Purification des amplicons et Séquençage Flashcards
Dans quel circonstance, la purification des amplicons pré-séquençage est nécessaire?
Lorsque la vérification sur gel d’agarose montre des bandes secondaires. La bande contenant le fragment d’ADN d’intérêt doit être découper rapidement après la migration.
Il est possible de les conservers au congélateur tel quel dans le gel.
Quel est le but de l’utilisation de la trousse d’extraction d’ADN à partir d’un gel d’agarose (FavorPrep) ?
Obtenir un échantillon d’ADN qui ne contient que les fragments d’ADN voulus pour le séquençage.
Pourquoi utiliser le FavorPrep, que permet-il de faire à l’échantillon ?
- éliminer les composantes de la réaction de la PCR et autres contaminants potentiellement nuisibles
- Améliorer la pureté de l’ADN
- Augmenter la concentration de l’ADN.
Quel est le principe de base de la méthode de purification des amplicons par FavorPrep (3 grandes étapes)?
1) l’ADN en solution se lie a la membrane de silice de la colone
2) un lavage de la membrane de silice à l’aide d’un tampon à base d’éthanol permet de retirer les contaminants en gardant l’ADN attaché à la colonne
3) l’ADN est élué à l’aide d’un tampon sans sel qui brise les liens ADN-silice
Quel matériel est nécéssaire pour la purification des amplicons?
- Trousse de FavorGen Biotech Corp: FavorPrep MicroElute Gel/PCR Purification Kit
- Transilluminateur UV, masque de protection faciale
- Lame de rasoir
- Microtubes
- Centrifugeuse
- Bain chauffant
- Balance
- Micropipettes
- Embouts
Décrit-moi la première étape de la purification des amplicons .
Étape 1:
- Identifier sur le gel la bande d’intérêt sur le transilluminateur
- À l’aide d’une lame de rasoir propre, découper la bande
- Éliminer au maximum la partie de gel sans ADN
Attention aux UV! porter la visère pour ces étapes
Décrit-moi la 2 et 3e étapes de la purification des amplicons.
Étape 2:
-Transférer le morceau de gel dans un mirotube préalablement pesé
Étape 3:
-Peser le tube avec le gel. Le poids du gel ne devrait pas excéder 200 mg.
Décrit-moi la 4e étape de la purification des amplicons.
Étape 4:
-Ajouter 500 µl de tampon MF dans le microtube contenant le gel découpé.
-Le tampon MF favorise l’adsorption de l’ADN à la silice: faible pH et Force ionique élevée
Décrit-moi la 5e étape de la purification des amplicons.
Étape 5:
-Incuber 5 à 10 minutes à 55°C en agitant toutes les 2-3 minutes.
Le gel d’agarose doit être totalement dissout avant de poursuivre.
Si la couleur du tampon change du jaune au mauve, le pH doit être ajusté avec de l’acétate de sodium.
Décrit-moi la 6 et 7e étapes de la purification des amplicons.
Étape 6:
-Insérer une minicolonne MF dans un tube collecteur
Étape 7:
- Transférer l’échantillon d’ADN dans la colonne
- Centrifuger
l’ADN se lie a la membrane, tandis que les autres contaminants passent à travers la colonne.
Décrit-moi les étapes 8 à 11 de la purification des amplicons.
Étape 8:
-Ajouter 600 µL de Tampon de lavage TW pour éliminer les contaminants
Étape 9:
-Centrifuger 2 fois, pour bien assécher la colonne
Étape 10:
-Éluer l’ADN en ajoutant 12 µL de tampon d’élution
Étape 11:
- Centrifuger
- l’ADN est supposé être dans le fond du microtube
La composition du tampon d’élution n’est pas favorable à la liaison de l’ADN à la silice: pH élevé et faible force ionique
Après la purification de l’ADN avec la FavorPrep, quels sont les 2 méthodes d’évaluation de la concentration de l’ADN purifié ?
1) à l’aide d’un colorant fluorescent:
- Par électrophorèse sur gel d’agarose en présence de GelRed.
2) Au spectrophotomètre:
- Non recommandé pour un échantillon d’ADN de faible concentration.
Quelle est la façon la plus fondamentale d’analyser l’ADN ?
Quel que soit le type d’ADN, c’est toujours de déterminer sa séquence en nucléotides.
Quelle est la principale méthode de séquençage de l’ADN?
La méthode de terminaison de chaîne de Sanger.
Quels sont les notions de bases importantes à savoir sur la synthèse de l’ADN par une ADN polymérase?
- l’ADN polymérase requière une amorce hybridée au brin d’ADN matrice pour la synthèse
- le nouveau brin d’ADN est produit en ajoutant à l’amorce des nt complémentaire à ceux de la matrice
- l’addition de nt au brin synthétisé se fait par la formation d’un lien covalent phosphodiester entre le phosphate en 5’ du nt à ajouter et l’hydroxyle à la position 3’ de la molécule en synthèse.
- Une amorce qui s’hybride à un endroit spécifique sur la matrice donnera des molécules d’ADN néosynthétiser qui débuteront tous au même endroit
