Saccharomyces cerevisiae - Organisme modèle

Question 1

Quels sont les petits nom qu’on donne a S. cerevisiae?

Answer 1

• Levure à pain
• Levure à bière
• Levure bourgeonnante

Question 2

Qu’est-ce qu’un levure ?

Answer 2

• Une levure est un champignon unicellulaire microscopique appartenant à la division Ascomycota.
• Paroi cellulaire composé des polymères de mannose et de glucose, et de chitine (N-acétyl-D-Gucosamines)

Question 3

Comment sont répartie les gènes de S. cerevisiae?

Answer 3

• 6275 gènes répartie sur 16 chromosomes dans une membrane nucléaire qui forme un noyau
• Haploïde = 16 chromosomes ou diploïde= 16 paires de chromosomes.
• Possède aussi une mitochondrie dont l’ADN code pour les enzymes de la voie respiratoire = plasmide 2 u (mu)
• L’ensemble du génome = 12 millions de pb et un contenu GC = 38%

Question 4

Vrai ou faux

S. cerevisiae se reproduit de façon sexuée et asexuée comme la majorité des Ascomycètes?

Answer 4

Vrai

Question 5

Quel est la forme de reproduction prédominante chez S. cerevisiae ?

Answer 5

• C’est la reproduction asexuée (ou végétative) et réalisée par bourgeonnement.
• Une “celllule-fille” émerge sous forme d’un bourgeon à partir d’une “cellule-mère”.

Question 6

Expliquez ce qu’on retrouve dans une culture en croissance exponentielle en reproduction Asexuée de levure?

Answer 6

• On observe généralement des proportions égales de cellules rondes en préparation de division mitotique, des cellules en début de division (petits bourgeons) et des cellules en fin de division (grands bourgeons).
• En conditions optimales de culture à 30°C, le temps de génération de S. cerevisiae varie de 75 à 120 minutes.

Question 7

Quels sont les 2 types sexués pour les cellules haploïde de S. cerevisiae?

Answer 7

• le type “a”

- le type “alpha”

Question 8

Quelles sont les 2 issus/action pour les cellules des 2 types sexuées?

Answer 8

1) les 2 types “a” et “alpha” peuvent se reproduire asexuellement par division mitotique
2) elles peuvent aussi participer à un processus de fusion (“mating”) si les cellules d’un type sont en présence de cellules de l’autre type sexuel.

Question 9

Expliquez ce qu’il se produit lors du processus de fusion des 2 types de cellules?

Answer 9

• Fusion lorsqu’il rencontre un du type opposé.
• Suite à cette fusion le zygote = cellule diploïde a/alpha.
• Les cellules diploïdes se reproduisent asexuellement mais ne sont pas capable de faire une nouvelle fusion.
• Les cellules diploïdes peuvent se diviser par méiose suivi d’une sporulation et génére 4 cellules haploïdes = 2 cellules de chaque type sexué (a et alpha).

Question 10

Quel particularité des cellules diploïdes est très utile en laboratoire?

Answer 10

Elles sont plus volumineuses que les cellules haploïdes = ~1,3 fois plus grande
-Cela est visible au microscope.

Question 11

Qu’est-ce qui facilite grandement l’étude de la fonction des gènes et représente un avantage indéniable chez la levure?

Answer 11

• Les cellules haploïdes possèdent un seul allèle pour la grande majorité des gènes, le phénotype associé à l’abolition de la fonction d’un gène peut-être observé directement.
• Par contre, pour l’étude des gènes essentiels à la survie, il faut utiliser les cellules diploïdes.

Question 12

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, comment inscrit-on les types sexuels?

Answer 12

• MATa
• MATalpha
• MATa/MATalpha
• MAT = “mating type”

Question 13

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, que veut dire ARG2 ?

Answer 13

locus (ou allèle) dominante

= apparaît en lettre majuscule

Question 14

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, que veut dire arg2 (arg = italique)?

Answer 14

locus (ou allèle) récessif

=apparaît en lettre minuscule et en italique

Question 15

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, que veut dire ARG2^+ ?

Answer 15

Type sauvage pour l’allèle du gène ARG2

= le + est en exposant

Question 16

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, que veut dire arg2-9 (arg en italique) ?

Answer 16

allèle mutant spécifique

recessif p/r du gène type sauvage ARG2+

Question 17

Dans la nomenclature de S. cerevisiae, que veut dire Arg2p ?

Answer 17

Protéine produire à partir du gène ARG2

= première lettre majuscule pour l’allèle dominant, pas d’italique et ajout de p pour protéine

Question 18

Quel est le type respiratoire de S. cerevisiae ?

Answer 18

Anaérobie facultatif

c-a-d un MO qui se développe mieux en conditions aérobie, mais qui est capable, en absence d’oxygène, d’utiliser le métabolisme fermentaire.

Question 19

Que ce produit-il lorsque la concentration de glucose dans le milieu est >0,8 mM ?

Answer 19

la levure va favoriser la fermentation = effet Crabtree

=Similaire à l’effet Warburg chez les cellules cancéreuses.

Question 20

Expliquez pourquoi on dit que S. cerevisiae est saccharolytique ?

Answer 20

Elle utilise principalement les sucres comme source de carbone et de préférence, les mono- et les disaccharides.

Ses principales sources de carbone et d’énergie sont les substrats suivants:

• Glucose
• Saccharose
• Mélibiose
• Maltose
• Éthanol
• Lactate
• Glycérol
• Pyruvate

Question 21

Que doit faire la levure lorsque la seul source de carbone est un composé à 2 ou 3 carbones ?

Answer 21

• lorsqu’il y a seulement du glycérol, de l’éthanol, du pyruvate ou du lactate, la levure doit synthétiser le glucose pour ses besoins cellulaires =Gluconéogénèse

Question 22

Que permet d’étudier la génomique fonctionnelle?

Answer 22

elle permet d’étudier comment fonctionnent les gènes et à décortiquer les réseaux complexes d’interactions des produits des gènes, les protéines, dans la cellule.

Question 23

Quel est la méthode la plus utiliser et importante en génomique fonctionnelle?

Answer 23

La mutagenèse puisqu’elle permet de comprendre le fonctionnement des gènes.

Question 24

Qu’est-ce que la mutagenèse?

Answer 24

C’est un processus biologique de modification stable de l’information génétique d’une organisme.

Ce produit à fréquence très basse dans la nature mais il constitue un élément essentiel de l’évolution, mais aussi à la base du développement de certains cancers et de plusieurs maladies héréditaires.

Question 25

En quoi consiste la mutagenèse expérimentale ?

Answer 25

c’est un outil puissant qui consiste à introduire des changements génétiques par le biais de l’action d’agents chimiques ou physiques. (ou moléculaire)

Question 26

Quels sont les 2 approches majeurs de mutagenèse moléculaire?

Answer 26

• Mutagenèse dirigée

- Mutagenèse aléatoire

Question 27

Qu’est-ce que la mutagenèse dirigée ?

Answer 27

• dirigée = un gène ou une partie de gène est remplacé par de l’ADN dont la séquence originale à été modifiée de façon contrôlée.
• Elle a toujours comme cible un seul gène connu = ne s’applique pas à la découverte de nouveaux gènes

Question 28

Qu’est-ce que que la mutagenèse aléatoire?

Answer 28

• C’est de la mutagenèse par insertion, des transposon sont utiliser pour modifier de façon aléatoire plusieurs gènes au sein d’une population de cellules.
• L’insertion même du transposon à pour effet de “marquer” le gène muté et devient un outil très efficace pour l’identification et le clonage moléculaire du gène en question.
• Cette méthode à permis de découvrir plusieurs nouveaux gènes et de leur attribuer leur fonction
• Utilise pas d’agents mutagènes à risque pour le chercheur.

Question 29

Quel autre application la mutagénèse à été utile ? (autre que pour la fonction d’une prot ou d’un gène)

Answer 29

Des nouvelles protéines ayant des propriétés différentes ou des fonctions renforcées peuvent être créées.

Question 30

Pour quelle raison il est essentiel pour les biologistes moléculaires et les microbiologiste de connaitre les principes de différentes méthodes de mutagenèse, de comprendre leurs applications et de pouvoir identifier et caractériser les gènes mutés et leurs phénotypes associés?

Answer 30

Pour avoir un meilleur contrôle du processus de la mutagenèse et pour faciliter l’étude des mutants qui en résultent.

Lors de la mutagenèse, un organisme modèle est généralement utilisé.

Question 31

Décrire brièvement le projet de BIM515 ?

Answer 31

• Modifier génétiquement la souche MVY800 de S. cerevisiae en effectuant une mutagenèse par insertion à partir d’une banque d’ADN génomique muté.
• L’insertion consiste à remplacer une partie de l’ADN génomique de la souche par de l’ADN muté par le biais d’une recombinaison homologue
• Isoler des mutants cataboliques incapable d’utiliser le glycérol comme source de carbone et d’énergie.
• Purifier 3 mutants et identifier les gènes affectés au niveau de la capacité à utiliser le glycérol et l’endroit précis de la mutation au niveau de la séquence génomique de la levure
• écriture d’un article scientifique, où il faut discuter du lien entre la fonction du gène muté et l’utilisation de glycérol, chez un des mutants choisit.

Question 32

Quelles sont les 8 étapes détaillées de la construction de la banque génomique?

Answer 32

1) Extraction et digestion partielle Sau3AI de l’ADN génomique (ADNg) de S. cerevisiae.
2) Séparation sur gel et extraction des fragments de 1,9-3,5 kb.
3) Remplissage partiel du surplomb 3’ des fragments Sau3AI avec dGTP et dATP.
4) Création du vecteur pHSS6-SaII par remplacement de la région NotI-NotI dans le site de clonage multiple (SCM) du pHSS6 avec un fragment porteur du site SalI.
5) Clonage des fragments Sau3AI modifiés dans le site SalI du pHSS6-SalI (banque génomiques)
6) Transformation de la banque génomique dans E. coli.
7) Insertion in vivo du mTn3-lacZ/LEU2.
8) Extraction d’ADN plasmidique (banque génomique mutée)

Question 33

Expliquez brièvement l’obtention et la sélection de mutants incapables d’utiliser le glycérol chez S. cerevisiae ?

Answer 33

• linéariser l’ADN transformant (à partir du stock d’ADNg représentant la banque génomique mutée) avec une enzyme de restriction.
• L’enzyme de restriction ne doit pas couper dans les fragments d’ADNg de la levure contenant mTn3-lacZ/LEU2 = avec une fréquence faible de coupe.
• transformer une souche haploïde de S. cerevisiae MVY800 (génotype: MATa leu2-delta98 ade2-101 lys2-801 Cir°) avec les fragments linéaires obtenus.
• La souche de base est auxotrophe pour la leucine, donc seulement les transformants ayant intégré le fragment portant le mini transposon Tn3 pourront y croitre.
• Avec les colonies obtenues leu+, faire un cribblage pour identifier les mutants déficient pour l’utilisation du glycérol comme seul source de carbone.

Question 34

Quel marqueur de sélection contenu dans le mini transposon Tn3, permet à la souche de synthétiser la leucine?

Answer 34

Le gène LEU2 codant pour la B-isopropylmalate déshydrogénase.

Question 35

Expliquez brièvement l’identification précise des mutations ?

Answer 35

• Fragmentation de l’ADNg isolé des cellules déficientes en catabolisme du glycérol à l’aide d’une enzyme de restriction, puis dilué et circularisé par ligation.
• Avec 2 amorces (PCR1 et PCR2) qui s’hybrident au transposon, faire l’amplification d’une partie du gène muté.
• Avec les mêmes amorces, séquencer le produit de l’amplification, faire l’alignement sur le génome de référence de S. cerevisiae et identifier le gène muté.

Question 36

Lors de l’identification précise des mutations, quel est l’enzymes de restriction choisit et pourquoi ?

Answer 36

Enzyme de restriction RsaI

• qui a un site de reconnaissance de 4 nucléotides (5’-GTAC-3’)
• Elle doit avoir une fréquence de coupe élevé donc cela donne une probabilité de coupure de 1 sur 288 pb, en moyenne.

Question 37

Lors de l’identification précise des mutations, à quoi sert la dilution après la fragmentation?

Answer 37

La dilution favorise la ligation intramoléculaire, ce qui permet d’obtenir des molécules circulaires contenant une partie du transposon et une partie du gène d’intérêt (fragment d’ADNg dans lequel Tn3 est inséré)

Question 38

Pourquoi les expériences identiques peuvent produire, par la PCR, des fragments de tailles différentes, même si le même gène est concerné?

Answer 38

• l’insertion du mTn3-lacZ/LEU2 dans une gène d’intérêt, qui apporte l’un des 2 sites RsaI (D’autres sites étant présent dans le gène conserné) est un phénomène aléatoire.
• Donc, la position du transposon chez 2 clones différents (étape chez E. coli), même si par chance initialement le même fragment Sau3AI a pu être cloné, ne sera probablement pas la même et par conséquent, la distance entre 2 sites RsaI sera différente.