Analyse de l'ADN muté et réaction de PCR

Question 1

Explique-moi brièvement en quoi consiste l’extraction de l’ADNg d’une souche de S. cerevisae.

Answer 1

• Dans l’optique d’obtenir, à la fin du projet, 2 séquences de gènes mutés, l’extraction de l’ADNg devrait être effectuée à partir de 3 mutants isolés, en suivant les instructions de la trousse commerciale de Bio Basic Inc. Rapid Yeast Genomic DNA extraction kit.
• Après le dosage au spectrophotomètre des ADNg purifiés, les 2 échantillons avec les concentrations des plus élevés seront utilisés pour la suite du projet.

Question 2

Quels étapes doivent être effectuer avant de débuter l’extraction ?

Answer 2

• Faire croitre les 3 mutants sélectionnés dans 5 mL de bouillon YEP/glucose, 24 h à 30 °C avec agitation forte.
• Préparer des microtubes avec 1,5 mL de culture, centrifuger 30 sec à vitesse maximale puis comparer le volume du culot obtenue avec un microtube d’eau contenant 30 à 40 µL. (si la biomasse du culot ne correspond pas à un volume de 30-40 µL, ajouter un autre volume de culture, centrifugé et comparer.)

Question 3

À quoi sert l’enzyme snailase?

Answer 3

C’est une enzyme qui dégrade la paroi cellulaire de la levure.

Question 4

Résume-moi les étapes de l’extraction d’ADNg, après la préparation des cellules.

Answer 4

1) ajouter au culot de cellule du tampon snailase, vortexter et ajouter du B-mercaptoéthanol et de l’enzyme snailase, incuber 3h à 37°C avec agitation lente
2) centrifuger 10 minutes à 3000 g et jeter le surnageant
3) ajouter le tampon de digestion universel (avec SDS et EDTA), suspendre le culot et incuber 60 minutes à 65°C. mélanger par inversion tous les 15 minutes.
4) ajouter la solution de RNase A et incuber 10 minutes à 37°C
5) ajouter le tampon PY ([sel] précipite les complexe protéine-SDS), agiter par inversion et placer 5 minutes à -20°C
6) centrifuger 5 minutes à 12000 g et transférer le surnageant dans un nouveau microtube
7) ajouter le chloroforme sous la hotte, mélanger par inversion 10 fois.
8) centrifuger 2 minutes à vitesse max et receuillir la phase aqueuse dans un autre microtube (mesurer le volume)
9) ajouter l’isopropanol, mélanger par inversion 5 fois et incuber a T° amb 5 minutes.
10) centrifuger 5 minutes à vitesse max et jeter le surnageant
11) faire 2 lavages du culot: ajouter éthanol 75% refroidi sur glace, inverser 10x, centrifuger 1 minutes a vitesse max et jeter le surnageant.
12) centrifuger 5 s et retirer tout le liquide avec une pipette.
13) laisser sécher à l’air en position horizontale
14) ajouter tampon TE, placer à 4°C pour au moins 30 minutes. lorsque le culot est dissout la digestion et l’estimation de la concentration au spectrophotomètre (A260,280,230) peut-être effectuer.

Question 5

Quel est le rôle du ß-mercaptoéthanol dans l’extraction d’ADNg ?

Answer 5

Le ß-mercaptoéthanol est un agent réducteur. Il permet donc d’éviter la dénaturation du matériel en maintenant un milieu réducteur semblable à l’intérieur de la cellule = éviter l’oxydation du matériel.

Question 6

Quel est le rôle de la RNase dans l’extraction d’ADNg ?

Answer 6

Elle permet de détruire les ARN présent dans l’échantillon et donc d’éviter la contamination de l’ADNg par de l’ARN.

Question 7

Quel est le rôle du chloroforme dans l’extraction de l’ADNg ?

Answer 7

Le chloroforme dénature les protéines présent dans la solution et permet de les faire précipiter et les retirer de la phase aqueuse qui contient l’ADN.

Question 8

Quel est le rôle de l’isopropanol dans l’extraction de l’ADNg ?

Answer 8

L’isopropanol permet de faire précipiter l’ADN dans la phase aqueuse recueilli.

Question 9

Quel est le rôle de l’éthanol 75% refroidi dans l’extraction de l’ADNg ?

Answer 9

L’éthanol 75% permet de laver le culot d’ADN. Il permet de retirer tous les autres constituants résiduels (autre que l’ADNg) de la solution pour purifier l’ADNg.

Question 10

Quel ratio A260/A280 est attendu pour de l’ADN db pure?

Answer 10

entre 1,85 -1,88

un échantillon est considéré propre avec un ratio >1,8

Question 11

Quels constituants peut faire diminuer le ratio A260/A280 ?

Answer 11

• contamination protéique ou phénolique

- aussi tout autre constituant qui absorbe fortement à 280 nm.

Question 12

Quel ratio A260/A230 est attendu pour de l’ADN db pure ?

Answer 12

entre 1,8 et 2,2

un échantillon est considéré propre avec une ratio >1,8

Question 13

Si le ratio A260/230 est < 1,8, qu’est-ce que cela veut dire ?

Answer 13

Cela démontre une contamination par un constituant qui absorbe fortement à 230 nm. La pureté de l’échantillon est faible.

contamination possible par des protéines et des sels.

Question 14

Pour la détermination des mutants pour continuer l’expérience, qu’est-ce qu’il sera sélectionner?

Answer 14

• Les échantillons qui possèdent des ratios A260/A280 et A260/A230 >1,8
• Les échantillons dont les Absorbance à 260, 280 et 230 nm sont les plus élevé car cela démontre une plus grande concentration d’ADNg dans l’échantillon.

Question 15

Pour l’identification du gène muté, la séquence originale à été muté par l’insertion du transposons, comme l’endroit précis de la mutation est inconnue, comment est-il possible de faire l’amplification par PCR ?

Answer 15

Il est possible de faire l’amplification PCR avec les régions connues comme sites d’appariement. Les amorces PCR1 et PCR2 ont des sites d’appariement qui se situent dans le gène lacZ retrouver dans le transposon mTn3-lacZ/LEU2.

Ces amorces pourront aussi être utiliser pour séquencer la régions de l’insertion du mTn3-lacZ\LEU2 dans le gène muté.

Question 16

Quel méthode à été utiliser pour calculer le Tm des amorces ?

Answer 16

Le modèle thermodynamique du « voisin le plus proche »

Question 17

Vrai ou faux

Si le site d’appariement des amorces ne se retrouvent pas de part et d’autre du gène à amplifier, une amplification direct par PCR est impossible ?

Answer 17

Vrai

La façon de contourner ce problème est de circulariser le fragment à amplifier, en conservant une partie de la région connue.

Question 18

Comment est-il possible de circulariser un fragment d’ADN linéaire à amplifier par PCR ?

Answer 18

Couper l’ADNg avec une enzyme de restriction, suivie par une ligation INTRAmoléculaire avec la T4 ADN ligase.

Question 19

Comment est-il possible de minimiser la probabilité de ligation intermoléculaire lors de la circularisation de l’ADNg ?

Answer 19

La solution d’ADN est préalablement dilué, et ainsi, favoriser la ligation intramoléculaire.

Question 20

Quels sont les constituants à mettre dans le microtube pour la digestion de l’ADNg extrait ?

Answer 20

• Tampon NEB 4 10X
• ADNg à ~ 10 µg
• Enzyme de digestion RsaI ~ 10 U
• Eau stérile

Question 21

Quels sont les 4 étapes de la digestion de l’ADNg extrait ?

Answer 21

1) préparer chaque extrait à digérer: Eau stérile, Tampon NEB 4, ADNg et RsaI.
2) incuber 2h à 37 °C
3) incuber 20 minutes à 80°C et conserver sur glace
4) vérifier la digestion par l’électrophorèse sur gel d’agarose 1%

Question 22

À quoi sert l’incubation de 20 minutes à 80 °C lors de la digestion de l’ADNg extrait?

Answer 22

Elle permet d’inactiver l’enzyme de digestion RsaI et ainsi, protéger le matériel.

Question 23

Quel est l’avantage de choisir un volume élevé de réaction de ligation ?

Answer 23

L’ADN se trouve fortement dilué dans la solution, ce qui favorise les liaisons intramoléculaires.

Question 24

Quel est l’avantage de choisir un volume élevé de réaction de ligation ?

Answer 24

L’ADN se trouve fortement dilué dans la solution, ce qui favorise les liaisons intramoléculaires.

Question 25

Quels sont les 4 composants de la réaction de ligation intramoléculaire ?

Answer 25

• Eau stérile de qualité “moléculaire”
• Tampon ligase 10X
• ADN digéré par RsaI
• T4 ADN ligase (400U)

Question 26

Quels sont les 4 étapes pour la ligation intramoléculaire de l’ADNg digéré ?

Answer 26

1) préparer la réaction: eau stérile qualité moléculaire, tampon ligase 10X, ADNg digéré par RsaI, T4 ADN ligase
2) incuber entre 14-20 h à la température de la pièce
3) incuber 20 minutes à 65°C
4) conservé à -20 °C

Question 27

Quels sont les conditions optimales de la réaction de PCR, déterminé expérimentalement ?

Answer 27

• température d’appariement de 66°C
• temps d’appariement entre 45 et 60 secondes
• concentration finale de 2 mM mgCl2

Question 28

Que permet l’utilisation de témoins pour la réaction de PCR ?

Answer 28

Pour l’éventualité où votre ADN ne serait pas amplifié ou pour valider un résultat positif, les témoins permettent d’analyser correctement la situation

Question 29

Quel est l’utilité du témoin négatif pour la réaction de PCR ?

Answer 29

pour confirmer qu’aucune solution utilisée n’était contaminée avec de l’ADN étranger

Question 30

Quels sont les utilités du témoin positif pour la réaction de PCR ?

Answer 30

• pour confirmer que les réactifs de la réaction sont adéquats et que l’appareil fonctionne correctement.
• (enzyme active et condition du mélange réactionnel sont adéquates)
• pour cela, il faut généralement utiliser un ADN cible pour lequel une amplification est normalement obtenue.

Question 31

À quoi sert la préparation d’un mélange réactionnel ?

Answer 31

• s’assurer que les conditions soient identiques dans les différents tubes (à l’exception des ADN cibles ou des amorces spécifiques)
• économie de temps
• diminution du taux d’erreur par pipettage répété de petits volumes

Question 32

Quels sont les composants du mélange réactionnel pour la réaction de PCR ?

Answer 32

• Eau stérile de qualité «moléculaire»
• Tampon PCR 10x (contient 15 mM MgCL2)
• MgCl2 (25 mM)
• amorce PCR 1 (25 µM)
• amorce PCR2 (25 µM)
• dNTPs (10mM chaque)
• ADN cible
• Taq polymérase (5 U/µL)

Question 33

Quels sont les 4 éléments majeurs dont dépend la réussite d’une amplification par la PCR ?

Answer 33

1) la concentration et la qualité de l’ADN cible
2) la concentration et le choix des amorces
3) les conditions d’appariement entre l’ADN cible et les amorces
4) les conditions d’amplification (élongation) par la polymérase

Question 34

Quel paramètre est crucial lorsqu’on utilise des amorces «universelles» ?

Answer 34

la pureté de l’ADN cible

• Surtout la certitude qu’aucun ADN étranger n’a contaminé la préparation
• Aussi le degré de purification d’ADN p/r aux autres constituants cellulaires

Question 35

Expliquer pourquoi la quantité d’ADN cible influence grandement la performance d’amplification par PCR ?

Answer 35

Car une cible rare, nécessite un nombre + élevé de cycles, ce qui augmente la probabilité des erreurs d’élongation. Aussi, une concentration trop forte d’ADN peut avoir un effet inhibiteur sur la PCR.

Question 36

Quel est la concentration optimal d’ADNg pour un volume de réaction de la PCR de 50 µL ?

Answer 36

entre 1 et 10 ng d’ADNg

toutefois, certaine situations peuvent nécessiter des quantités d’ADN de 100 ng ou +

Question 37

En quoi l’intégrité d’ADN est un facteur important pour l’amplification par PCR ?

Answer 37

Car + l’ADN est fragmenté (briser par un traitement physique ou enzymatique) et + il sera difficile d’amplifier des fragments de grande taille.

Question 38

Lors de la planification et optimisation des la méthode d’amplification par PCR, quel facteur est le moins prévisible?

Answer 38

Le choix et la construction des amorces.

Question 39

Quels sont les 7 règles générales pour le choix des amorces pour une réactions de PCR ?

Answer 39

1) la longueur des amorces, entre 18-24 nt
2) le contenu en GC entre 40 et 60%. la distribution GC/AT devrait être équilibrée et sans séquences répétitives de la même base
3) L’extrémité 3’ de l’amorce devrait être - «collante» que la 5’. Un G ou un C en 3’ est souhaitable.
4) les séquences palindromique et les séquences permettant la formation des structure secondaire est à évitée
5) les 2 amorces ne doivent pas être complémentaires sinon dimère
6) T° d’appariement aussi proche que possible du Tm des 2 amorces. > 55°C et idéalement entre 62-72 °C
7) La concentration pour chaque amorce devrait se situer entre 0,1 et 0,6 µM.

Question 40

Qu’est-ce que le Tm ?

Answer 40

C’est la T° de fusion à laquelle 50% des molécules d’une amorce sont hybridées à la séquence cible

Question 41

Quel est la règle générale pour la T° d’appariement ?

Answer 41

Tx correspond à Tm -5°C

Mais la T° optimale d’appariement doit être un compromis entre la haute spécificité et le haut rendement.

Question 42

À quoi correspond le temps d’appariement ?

Answer 42

C’est le temps nécessaire pour que la «rencontre» entre 2 séquences complémentaires puisse avoir lieu.

Question 43

Explique-moi en quoi le temps d’appariement est un facteur important pour la PCR?

Answer 43

Car une augmentation du temps d’appariement augmente aussi la probabilité des appariements non-spécifiques.

Aussi, au fur et a mesure que les cycles de la PCR progressent, la concentration des amorces disponibles diminue et donc, dans certaines situations, le temps d’appariement devrait être augmenté.

Donc, le temps d’appariement plus court va avoir l’effet d’augmenter la spécificité, mais aussi, de diminuer le rendement d’une PCR (moins d’amplicon synthétisé)

Question 44

Dans quel condition l’ADN doit-il être pour que les amorces puissent s’hybrider à leur séquences cibles?

Answer 44

l’ADN db doit être dénaturé en ADN sb en chauffant le mélange à 96 °C

• dénaturation initiale ~2-3 minutes = suffisant pour dénaturer un ADN complexe
• les cycles suivants ~20-30 secondes

Question 45

Que produisent les ions Mg2+ dans la réaction de PCR?

Answer 45

• ils forment des complexes solubles avec les dNTP et avec l’ADN.

Question 46

Quels sont les véritables substrats pour la polymérase dans la phase d’élongation ?

Answer 46

Ce sont les complexes solubles formés entre les ions Mg2+, les dNTP et l’ADN.

Question 47

Explique-moi en quoi la concentration adéquate en ions Mg2+ est un facteur important lors de l’élongation d’ADN ?

Answer 47

• Avec une concentration insuffisantes de Mg 2+, peu de produit sera amplifié,
• Avec une concentration excessive, cela augmente la probabilité de formation des produits non-spécifiques.

Question 48

Quel est la concentration optimale d’ions Mg2+ de départ dans une réaction de PCR?

Answer 48

des concentrations de 1,5 mM de MgCl2 et de 200 µM pour chaque dNTP sont généralement un bon point de départ.

Question 49

Quels composés utilisés lors de l’extraction de l’ADNg doivent être éliminer car il sont de inhibiteurs important de l’activité enzymatique ?

Answer 49

les composés organiques résiduels, tels que le phénol, le chloroforme ou l’éthanol.

Question 50

Vrai ou Faux

La T° optimale d’élongation est toujours de 72 °C

Answer 50

Faux

La T° optimale d’élongation dépend de l’enzyme polymérase utilisés. Pour la Taq polymérase c’est 72°C mais elle doit être confirmé avec le fabriquant pour les autres.

Question 51

Pourquoi un temps de dénaturation de 20-30 secondes à 94°C est suggéré dans une réaction de PCR?

Answer 51

Il est important de ne pas fatiguer la polymérase à haute température. Un temps maximale de 30 secondes est suffisant pour dénature l’échantillon et la polymérase maintient son activité optimale.

Question 52

Quel serait l’impact si on Diminue ou Augmente le temps d’hybridation dans la réaction de PCR? (normalement 20-30 secondes)

Answer 52

Temps diminuer = provoque une faible amplification

Temps augmenter = provoque une amplification non-spécifique

Question 53

Quel serait l’impact si on Diminue ou Augmente la Température d’hybridation dans la réaction de PCR? (normalement T° = Tm -5°C )

Answer 53

T° diminuer = amplification non-spécifique

T° augmenter = amplification plus faible

(les conséquences sont inversement proportionnel au temps)

Question 54

Quel serait les conséquences d’une faible concentration d’ADN cibles dans une réaction de PCR?

Answer 54

Ça provoque une amplification plus faible

Question 55

Quels seraient les conséquences d’une forte concentration d’ADN cibles dans une réaction de PCR?

Answer 55

1) augmentation considérable de l’amplification non-spécifique
2) Provoque un effet de dilution avec les autres composants du mélange: l’augmentation d’ADN cible fait en sorte que l’amplification est beaucoup plus faible et une dilution de la spécificité.

Question 56

Sur gel d’électrophorèse post-PCR, Que signifie la présence d’une trainer blanchâtre ?

Answer 56

Ça représente une amplification non-spécifique, l’effet de dilution peut annuler la présence d’ADN cible.

Question 57

Quel serait l’impact d’une Diminution ou d’une Augmentation de la concentration de MgCl2 dans une réaction de PCR?

Answer 57

Diminution = amplification plus faible

Augmentation = favorise le non-spécifique car ça agit comme une colle pour les amorces sur l’ADN.

Question 58

Quel serait l’impact d’une Diminution ou d’une Augmentation de la concentration des amorces dans une réaction de PCR?

Answer 58

Diminution = amplification plus faible

Augmentation = amorces vont coller à des séquences non-spécifique et donc favoriser l’amplification non-spécifique

Question 59

Quel serait l’avantage d’augmenter le temps d’élongation au fur et a mesure que la réaction de PCR avance?

Answer 59

Comme il y a de moins en moins de briques disponible pour la constructions de nouvelles molécules, augmenter le temps faciliterait le travail de la polymérase et comme ça on s’assure que tous les produits amplifier seront complets.

Question 60

Qu’est-ce qui dicte la température d’élongation utiliser dans la réaction de PCR?

Answer 60

ça dépend de l’enzyme ADN polymérase utiliser pour la réaction. Certaine sont plus rapide que d’autre, mais l’ensemble des polymérases travaille entre 68-75 °C. Avec la Taq polymérase, la T° optimale est de 72°C

Question 61

À quoi sert l’étape d’élongation finale de 7 minutes à la fin de la réaction de PCR?

Answer 61

Cette étape permet de s’assurer que tous les produits amplifier durant la réaction sont tous double brin et entier.

Question 62

Durant le laboratoire, la température d’hybridation utiliser pour les amorces PCR1 et PCR2 était de 8-9 °C au dessus des leur Tm. (66°C pour un Tm de 57-58°C). Quels sont les 3 modifications possibles des conditions expérimentale qui peuvent compensé l’augmentation de la T° ?

Answer 62

1) Augmenter la concentration des amorces
2) Augmenter le concentration de MgCl2 >1,5mM
3) Augmenter le temps d’Appariement.

c’est 3 conditions favorisent le non-spécifique qui permettrait de balancer la trop grande augmentation du spécifique et donc compensé la diminution de l’amplification.