Transcriptomics Flashcards
Wat gebeurd er bij Northern blotting?
RNA-samples afkomstig van verschillende weefsels/tijden/ontwikkelingspunten op een agarosegel geplaatst, hier vindt elektroforese (elektrische scheiding) op basis van grootte plaats. Op de gel wordt een nylon/nitrocellulose membraan geplaatst, waar capillary action ervoor zorgt dat het RNA op het membraan terecht komt. Er worden probes bijgevoegd die kunnen binden met de RNAs op het membraan, de probes zijn radioactief gelabeld of met een epitoop die reageert met antilichamen. De intensiteit van hybridisatie van de probes aan het RNA, bepaalt de hoeveelheid RNA.
Hoe zorg je ervoor dat er een accurate hoeveelheid RNA gemeten wordt bij Northern Blotting (4 voorwaarden)?
- Integriteit van RNA controleren, gedeeltelijk afgebroken RNA zorgt voor een vertekend beeld van de intensiteit van hybridisatie.
- Er moeten meer gelabelde probes zijn dan er RNA is.
- De probes moeten genoeg tijd hebben om het RNA te vinden.
- Er moet een onafhankelijke manier zijn hoe aangetoond kan worden dat gelijke hoeveelheden RNA in elke baan van de gel geplaatst zijn, wordt meestal gedaan met een tweede probe dat hybridiseert met RNA dat overal in gelijke hoeveelheden voorkomt.
Wat is het nadeel van northern blotting?
Het is beperkt tot het aantal banen in de gel (20-40) en het aantal probes (3).
Wat zijn eigenschappen van microarrays?
- Van een volledig gesequenced genoom kan de expressie van alle genen door microarrays geanalyseerd worden.
- DNA is gebonden aan een solide ondergrond (de probe).
- RNA wordt direct gelabeld of er wordt een cDNA intermediar gebruikt.
- Wordt gebruikt om RNA populaties met elkaar te vergelijken (tumor vs gezond bijv).
Wat is mechanical spotting/spotted microarray?
Hierbij worden kleine hoeveelheden DNA op glasplaatjes geplaatst. De kleine hoeveelheden DNA worden door een robot die meerdere pinnen bij zich draagt op het glasplaatje geplaatst, dit gaat door capillary action. Vervolgens wordt er van het target RNA cDNA gemaakt en wordt deze direct gelabeld met Cy3 (groen), de controle cDNA wordt gelabeled met Cy5 (rood). De cDNAs gaan competitieve hybridisatie aan en vervolgens wordt er met 2 verschillende golflengtes de fluorescentie-intentiteit gemeten. Wanneer een puntje geel aankleurt, betekent dit dat het RNA in beide weefsels evenveel voorkomt.
Wat is een GeneChip?
Dit is een microarray met een hoge dichtheid, waarbij oligonucleotiden op een silicone chip vast zitten.
Hoe wordt een GeneChip toegepast bij photolithography?
Bij photolithography wordt er bij elke stap gebruik gemaakt van licht (en masker). Het masker zorgt dat het licht op de plekken op de GeneChip komt waar een nucleotide aan de oligonucleotideketen toegevoegd kan worden.
Hoeveel custom maskers heb je nodig om een chip te maken die 20 bp oligonucleotiden lang is?
80 custom maskers.
Hoe wordt de intensiteit van hybridisatie bepaald bij GeneChips en hoe wordt dat gedaan bij spotted microarrays?
Bij GeneChips door het vergelijken van twee targets op twee verschillende chips. Bij spotted microarray gaat dit op basis van competitieve hybridisatie.
Wat is indirect labeling en voor welke techniek is dit nodig?
Target RNA wordt omgevormd tot dubbelstrengs cDNA, het bevat ook een herkenningsplek voor RNA-polymerase. Viraal polymerase zorgt voor vorming van cRNA, deze nucleotiden zijn gelabeld met biotine dat wordt herkend door fluorescent gelabeld avidine.
Waarom is normalisatie van belang bij microarray analyse?
Omdat de hoeveelheid Cy3 en Cy5 die gebonden zijn aan de targets kunnen verschillen.
Als de groen/rood ratio afwijkt van 1 dan zal het mRNA …
Verschillend tot expressie komen in de verschillende weefsels.
Wat zijn andere technieken om genome-wide expressie profielen te vinden?
ESTs en short ESTs (SAGE) en Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)
Wat is het voordeel van het gebruik van MPSS?
De sensitiviteit van MPSS is voldoende om mRNAs te vinden die in mindere mate tot expressie komen in cellen.
Wat is real-time PCR en wat is een voordeel ervan?
Een andere methode om RNA te meten. Het aantal RNAs dat tegelijkertijd gemeten kunnen worden is lager (96), maar de sensitiviteit is beter en de methode is goedkoper dan SAGE of MPSS.
