Genome manipulation techniques

Question 1

Forward genetics is..

Answer 1

Het aanbrengen van willekeurige mutaties en het organisme onderzoeken op welk gen verantwoordelijk is voor het nieuwe fenotype.

Question 2

Reverse genetics is…

Answer 2

Het muteren van een specifiek gen om de functie te kunnen achterhalen.

Question 3

Wat zijn drie ‘voorwaarden’ van chemische mutagenese?

Answer 3

• Substitutie enkele nucleotide
• Gebeurd op voorspelbare frequentie
• Gebeurd geheel willekeurig

Question 4

Wat zijn de meest gebruikte mutagenen?

Answer 4

ENU en EMS

Question 5

Wat doet ENU?

Answer 5

ENU plaatst een ethylgroep op basen, voornamelijk thymine.

Question 6

Wat doet EMS?

Answer 6

EMS plaatst een ethylgroep op guanineresiduen, DNA-polymerase herkent dit als adenineresidu, hierdoor nucleotidesubstitutie.

Question 7

Waarom wordt bij vliegen het P-element het meest gebruikt als transposon-induced mutagenese?

Answer 7

Het P-element controleert de activiteit van transposase, hierdoor blijft de locatie van het P-element stabiel.

Question 8

Wat is imprecise excision?

Answer 8

Dit gebeurd bij transposon-induced mutagenese, het weghalen van de transposon neemt ook omringend DNA mee. De grootte van de deletie is variërend, waardoor er allelische varianten ontstaan.

Question 9

Waarom is het gebruik van transposon-induced mutagenese makkelijker om de mutante genen terug te vinden?

Answer 9

Omdat de DNA-sequentie van de transposon bekend is en gebruikt kan worden om een primer te maken.

Question 10

Waaruit bestaat de cassette van een transgen?

Answer 10

Uit een promotor, een coderend gebied, poly(A) signaal.

Question 11

Waardoor kan de activiteit van de promotor van het transgen beïnvloed worden?

Answer 11

Door de plek waarin het transgen zich voegt.

Question 12

Waarvoor wordt transgenese voornamelijk gebruikt?

Answer 12

Om eiwitten tot overexpressie te laten komen.

Question 13

Waar wordt een transgen geïntroduceerd in cellen/organismen?

Answer 13

In geslachtscellen of embryo’s.

Question 14

Beschrijf kort hoe transgenese werkt bij muizen.

Answer 14

Een transgen wordt bij muizen in embryo’s geïnjecteerd. Hiervoor worden eerst de follikelcellen weggehaald met het enzym hyaluronidase, hierdoor komen de zona pellucida, poollichaampje en 2x pronuclei tevoorschijn. De zygote wordt vastgehouden met de zuigkracht van een pipet, een andere pipet injecteert het DNA in de pronucleus. De pronucleus zwelt op en de zygote ontwikkelt zich tot een 2-cellige embryo. De embryo’s worden teruggestopt in een draagmuis en ontwikkelen zich verder.

Question 15

Wat is het principe van homologe gen targeting?

Answer 15

Hier wordt een specifieke chromosomale regio vervangen met ontworpen exogeen DNA.

Question 16

Hoe blijven ES-cellen stabiel?

Answer 16

Door de cellen op een LIF- en MEFs-verrijkt medium te laten groeien.

Question 17

Wat zijn de eigenschappen van een targeting vector?

Answer 17

De vector moet (1 korte en 1 langere ) arm hebben voor homologe recombinatie en het moet een selecteerbare marker hebben.

Question 18

Hoe wordt de targeting vector in de ES-cellen geïntroduceerd en hoe worden de ES-cellen met de vector vervolgens geselecteerd?

Answer 18

Via elektroporatie en daarna via positieve selectie a.d.h.v. G418.

Question 19

Wat is germline transmission en waardoor wordt dit meestal herkent?

Answer 19

Succesvolle overerving van de gemodificeerde cellen, wordt meestal herkend doordat de gemodificeerde muizen een andere vachtkleur hebben.

Question 20

Waarvoor wordt RNAi voornamelijk gebruikt?

Answer 20

Voor knock-down of gene-silencing.

Question 21

Hoe komt RNAi tot stand?

Answer 21

Het dicer enzym herkent dubbelstrengs RNA en kan dit in small interfering RNAs (siRNAs) knippen. Deze binden aan het complex RISC, waar het siRNA van elkaar wordt gescheiden. Een van deze strengen (guide strand) bindt vervolgens aan complementaire sequentie van zijn target mRNA, hierdoor wordt translatie verhinderd.

Question 22

Wat gebeurd er als de guide strand van een siRNA niet volledig complementair is met het targetgen?

Answer 22

Dan ontstaan er uitstulpingen bij binding, dit dubbelstrengs mRNA komt ribosomen wel binnen maar verder kan translatie niet plaatsvinden.

Question 23

Hoe silence je een gen bij RNAi?

Answer 23

Eerst wordt bepaald welke sequentie getarget moet worden, deze sequentie wordt gekloneerd in een expressievector en ook de complementaire sequentie hiervan bevindt zich in de vector. Bij expressie vouwt het RNA zich samen als een hairpin (shRNA). Dit molecuul kan door dicer verwerkt worden en er ontstaat siRNA dat translatie kan inhiberen.

Question 24

Wat is homologe en niet-homologe end joining?

Answer 24

Homologe end joining is door het intacte chromosoom te vergelijken met de chromosoom waar een DSB zit. Hierdoor kan de DSB erg precies gemaakt worden. NHEJ plakt de DSB gewoon aan elkaar, de kans op fouten is hierbij groot.

Question 25

Welke andere technieken maken gebruik van DSBs?

Answer 25

zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENS), meganucleases (restriction enzymes with exceptionally long recognition sequences) and CRISPR/Cas.

Question 26

Uit welke drie elementen bestaat het operon van CRISPR/Cas (in de natuur)?

Answer 26

• Een CRISPR repeat region, codeert voor crRNA.
• Element dat codeert voor tracrRNA.
• Element dat codeert voor Cas9.

Question 27

Waaruit bestaat een crRNA?

Answer 27

Het bevat een variabele sequentie (protospacer), dit is de sequentie die identiek is aan een pathogeen. En een constante sequentie identiek aan de CRISP repeat.

Question 28

Wat gebeurd er wanneer een bacteriële cel wordt geïnfecteerd door een bacteriofaag (2e infectie)?

Answer 28

De pathogene sequentie is al eerder geïncorporeerd in de sequentie, bij binnenkomst van de pathogeen wordt de sequentie gematched met de protospacer dat vervolgens met de pathogene sequentie bindt. Ca9 knipt het DNA van de pathogeen in een DSB waardoor het pathogeen onschuldig wordt.

Question 29

Waaraan grenst de targetsequentie?

Answer 29

Aan het PAM, met sequentie nGG

Question 30

Waaruit bestaat een operon van CRISPR-Cas voor genetische modificatie?

Answer 30

GuideRNA, met de targetsequentie en het crRNA en tracrRNA.

Cas9 enzym