Proteomics Flashcards
Op welke twee manieren worden eiwitten bij 2D gelektroforese gescheiden?
- Eerst worden de eiwitten gescheiden op basis van hun lading op een strook van polyacrylamide met een continue pH gradiënt. De spanning die op de gel staat zorgt dat de negatief geladen eiwitten naar beneden worden getrokken. De pH gradiënt zorgt ervoor dat de lading van het eiwit wordt geneutraliseerd, waardoor het eiwit niet meer door de gel beweegt.
- Hierna wordt de strook eiwitten overgeplaatst op een gel met een constante pH, een lading wordt aangebracht waardoor de eiwitten gescheiden worden op basis van hun moleculaire gewicht.
Wat is differential in gel elektroforese (DIGE)?
Hier wordt er gebruik gemaakt van twee soorten populaties (bijv bacteriën, 1 groeit in aanwezigheid van een zuur, de ander in afwezigheid ervan). De eiwitten hiervan worden gelabeld met Cy3 en Cy5 en vervolgens geanalyseerd via 2D gelelektroforese. De gel wordt blootgesteld aan de twee verschillende golflengtes van Cy3 en Cy5 en deze kunnen met elkaar vergeleken worden.
Wat zijn nadelen van 2D gelelektroforese?
- Het werkt niet goed met hele grote of hele kleine eiwitten, of met eiwitten die niet veel tot expressie komen.
- Membraangebonden eiwitten kunnen niet gekarakteriseerd worden.
De eerste stap bij massaspectrometrie is ionisatie (het knippen van moleculen om fragmenten te maken met een ionische lading). Welke twee technieken zijn hiervoor?
Electrospray ionization (ESI) en matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)
Wat gebeurd er bij de ionisatie van eiwitten m.b.v. ESI?
Hier wordt bijv. capillary elektroforese gebruikt, hierbij worden de eiwitten gescheiden via nauwe buisjes die a.d.h.v. lading de eiwitten naar beneden trekken. Aan het eind wordt het eiwit geïoniseerd, de eiwitten verdampen en de geladen peptide ionen blijven over.
Wat gebeurd er bij de ionisatie van eiwitten m.b.v. MALDI?
Weefsel wordt in een matrix gelegd dat een chemisch stofje bevat die UV-licht kan opnemen, wanneer een laser zich hierop richt wordt de matrix heet en verdampen en ioniseren de eiwitten.
De tweede stap bij massaspectrometrie is het meten van de massa-naar-lading ratio van de gevormde eiwitten. Dit kan gedaan worden m.b.v. twee soorten massa analyzers, welke zijn dit?
Time-of-flight en ion-trap.
Wat is ion-trap en in combinatie met welke ionisatie techniek wordt dit gebruikt?
Het wordt vaak gebruikt bij ESI. De ion-trap werkt als een soort radio, waarbij ze afgesteld kunnen worden om alleen bepaalde ionen met een specifieke massa-naar-lading-ratio te accepteren. Deze ionen worden opgevangen, gefragmenteerd en in een massaspectrum gezet.
Wat is time-of-flight en in combinatie met welke ionisatie techniek wordt dit gebruikt?
TOF wordt gebruikt bij MALDI. De ionen van eenzelfde ionenbron hebben dezelfde soort kinetische energie. en zullen dus met een bepaalde snelheid door de detector komen. De aankomsttijd bij de detector wordt hier gemeten om de massa-naar-lading ratio te kunnen berekenen.
Waarom kunnen eiwitten niet gelijk bewerkt worden door ESI of MALDI?
Ze zijn nog te groot voor de analyse en moeten eerst gefragmenteerd worden. Dit wordt gedaan met een protease zoals trypsine. Hiermee kan ook een controle worden gedaan, waarbij voor alle eiwitten voorspelt wordt waar trypsine zal knippen en hiervan wordt de verwachte massa berekent. Dit kan vervolgens vergeleken worden met de resultaten uit de massaspectrometer.
Wat is stable-isotope protein labeling en waarvoor wordt het gebruikt?
Het wordt gebruikt om verschillen in eiwitexpressie bij verschillende experimentele omstandigheden te kwantificeren. Stabiele isotopen zijn niet-radioactieve isotopen. Je kan hierbij bijv. bacteriën op twee kweekmedium laten groeien, met een kweekmedium aminozuren met isotoop 13C. Deze eiwitten worden uiteindelijk gemengd en geknipt door trypsine als voorbereiding op de analyse. Hieruit komt een massaspectrum van de wel en niet gelabelde eiwitten dat de relatieve aanwezigheid vertoont van het eiwit onder twee verschillende experimentele omstandigheden.
Waarom is Isotope Coded Affinity Tagging (ICAT) nuttig?
Om kwantiteiten te meten met massaspectrometrie.
Wat gebeurd er bij ICAT?
Twee eiwitsamples worden gelabeled met elk een andere ICAT reagent. De eiwitten worden vervolgens gefragmenteerd, waarbij de peptiden met ICAT gezuiverd worden via affiniteitschromatografie. Zo kunnen de peptiden geanalyseerd en gekwantificeerd worden.
Hoe komt binding tot stand tussen een ICAT reagent en het eiwit? En welke groep bij de ICAT tag is belangrijk bij affiniteitschromatografie?
Het ontstaan van een covalente binding tussen cysteïne van eiwitten en de thiolgroep van de reagent. De biotingroep is belangrijk bij affiniteitschromatografie.
Hoe kan een pull-down experiment gebruikt worden om nieuwe interacties tussen eiwitten te vinden?
Hierbij wordt een prooi-eiwit gezuiverd, waarbij de eiwitten die hieraan binden meegezuiverd worden. Massaspectrometrie kan uitgevoerd worden om de identiteit van de eiwitten te vinden.
