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TEMAS 4 Y 5. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR I Y II Flashcards

1
Q

En qué se centran los métodos y técnicas de biología molecular

A

Estructura, función y regulación de las mokecuals biológicas

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Q

Uso de ELISA

A

Identificación y cuantificación de analitos de naturaleza proteica

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3
Q

Tipos de ELISA

A

Directo
Indirecto
Sandwich
Competitivo

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4
Q

Uso de Elisa directo

A

Analizar la respuesta inmune a un determinado antígeno

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5
Q

Uso de Elisa Indirecto

A

Determinar concentración total de Ac en una muestra

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6
Q

Uso de ELISA tipo sandwich

A

Analizar muestras complejas
No es necesario purificar el Ag previamente

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7
Q

Uso de ELISA competitivo

A

Detectar Ag de pequeño tamaño o en muy bajas concentraciones en la muestra

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8
Q

Pasos del lector de microplato

A
  • TMB: color azul
  • Stopper (H2SO4) : color amarillo
  • Mezclar 10 min
  • Meter en espectrofotómetro 450 nm
  • Recta de calibrado (rango 0 - 0.1)
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9
Q

Nombres que se le da a la técnica del Western Blot

A

Protein blotting
Imnunoblotting

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10
Q

Cómo funciona el Western Blot

A
  • Muchas cosas, pero separación por electroforesis
  • Las proteínas grandes de mueven menos
  • Se pasa a membrana (inmunoensayo) y se le pone Ac primario y secundario, fluoróforo (luz en banda)
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11
Q

Qué moléculas sirven para el inmunoensayo medio húmedo de Western Blot

A

Moléculas grandes

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12
Q

Ventajas y desventajas del inmunoensayo semi seco

A

Más rápido pero se puede secar y estropear la muestra

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13
Q

Pasos de la hibridación en el WB

A
  • Hibridación de proteína diana con Ac primario
  • Hibridación de Ac primario con Ac secundario marcado con peroxidasa de rábano
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14
Q

Pasos del revelado en WB

A
  • Peroxidasa de rábano catalizada la oxidación de luminol en peróxido de hidrógeno
  • Luminol emite señal luminosa
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15
Q

Qué le ocurren a las proteínas en el WB

A

Se desnaturalizan

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16
Q

Aplicaciones biomédica del WB

A
  • Prueba conformatoria del VIH
  • Prueba definitiva de Creutzfeldt-Jakob
  • Dx de Turalemia
  • Enf de Lyme, VHB, HSV-2
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17
Q

Cómo está la muestra en la inmunoprecipitación de proteínas

A

Completamente lisada

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18
Q

Pasos de la inmunoprecipitación de proteínas

A
  • Lisa muestra
  • Añade Ac con bola magnética para mol específicas
  • Se pasa imán
  • Se limpia lo no pegado
19
Q

Uso de la inmunoprecipitación de proteínas

A

Aislar y concentrar una proteína particular de la muestra

20
Q

Cómo están las muestras en el Dot Blot

A

En condiciones nativas
No se usa Ac monockonales

21
Q

En qué se basa la PCR

A

Replicación exponencial de un fragmento de ADNg o ADNc mediante ciclos que constan de 3 temperaturas

22
Q

Componentes PCR (7)

A
  • Cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde
  • Enzima ADNpol
  • Cofactores necesarios para la actividad correcta de la ADN polimerasa
  • Desoxinucleótidos (dNTP) para la síntesis del producto de PCR
  • Oligonucleótidos o primers
  • Taq polimerasa
  • Termociclador
23
Q

Funcionamiento PCR

A
  • Eleva la temperatura
  • Se desnaturalizan los fragmentos
  • Se baja un poco la temperatura y se anillan los primers
  • De nuevo se disminuye hasta que funcione la Taq
    polimerasa y alargue esos fragmentos de ADN
24
Q

Pasos de la PCR (4)

A
  • Inicio de la desnaturalización
  • Ciclos de amplificación (3)
  • Amplificación final
  • Almacenamiento temporal
25
Ciclos de amplificación de la PCR (3)
- Temp de desnaturalización - 95º - Temp de alineamiento - 50º - Temp de extensión - 72º
26
Fórmula para la cantidad de producto de PCR
P = 2^nxT n = nº ciclos T= nº copias iniciales de la molécula molde
27
Tipos de PCR (4)
- Convencional - Cualitativa - Semicuantitativa - Cuantitativa
28
PCR convencional
Tras terminar termociclador, se realiza electroforesis en gel de agarosa o acrilmida
29
PCR cualitativa
Detecta presencia o no de un gen Usado en forense
30
PCR semicuantitativa
Expresión génica de una persona Sobre todo ARNm
31
PCR cuantitativa
Cuantifica en números absolutos ADN en una muestra Usado para cargas virales de covid Usa ARNm
32
Modelos en los que se basa la RT-PCR
- Fluoróforos: primera dan señal que se cuantifica - Sondas específicas marcadas con fluorocromos: primer da señal ante sonda - Agentes intercalantes fluorescentes (Sybergreen)
33
Técnicas de hibridación de ácidos nucléicos (4)
- Southern blot y northern blot - Enzimas de restricción - Hibridación de la sonda - Hibridacion in situ FISH
34
Southern blot: qué hace y cómo
- Analiza ADN previamente digerido con enzimas de restricción - Se ponen en un gel de agarosa y se traspasan aún blotting para hibridarlos con sondas específicas
35
Northern blot
Similar al SB pero se analiza ARN y no se usan enzimas de restricción
36
Enzimas de restricción: cómo se nombran
1- género bacteria de la que extrajo 2y3 - especie 4 - cepa o estirpe 5 - endonucleasa
37
Hibridacion de la sonda: procedimiento y actividades que conbina
- Procedimiento Nick translation - DNAsa 1: suprime nucleotide al azar en una de las dos candenas - ADNpol: incorporan nuevos nucleótidos por complementariedad
38
Hibridación in situ FISH: tipo de método y cómo funciona
- Método inmunohistoquímico - Sondas son marcadas con fluorescencia
39
Cómo se realiza el FISH
Directamente sobre tejidos, con sondas de ADN directamente sobre las muestras
40
Procedimiento del FISH (4)
- Colocar hibridación en porta - 37º en cámara Punnet por 16-72 horas - Colorante para núcleos y se revela - Se observa al microscopio genes determinados
41
Aplicaciones del FISH (2)
- detectar mutaciones en ADN - indentificacion ARNm subcelular en la fijación del tejido
42
3DISCO: qué hace
- Hace que muestras biológicas sean transparente usando disolventes orgánicos para igualar el índice de refracción del tejido y medio circundante - Se examinan mediante microscopía de fluorescencia
43
Pasos de la 3DISCO (3)
- deshidratación inicial, con tetrahidrofurano - extracción de lípidos mediante incubación en diclorometano - emparejamiento del índice de refracción con Éter dibencíclico
44
Brainbow: cómo funciona
Fluorescencia para marcar, en el cerebro humano, cualquier tipo de neuronas, incluido su axón, y ver cuál es el destino de cada neurona desde el inicio

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