Tema 5: EMBRIÓN Flashcards
- DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
Permite conocer algunas de las características del embrión para estimar su valor y rentabilidad
Incluso permite conocer características indeseadas y descartarlo automáticamente
Determinamos : Genotipo y Fenotipo
- DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
1.1 DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO (SEXO)
- Tecnicas y explicación
Siempre se produce un daño severo al embrión al hacer la BIOPSIA EMBRIONARIA (¡Cuantas más células se extraigan mayores daños se producen!)
1. Embrión en fase mórula :
muestra de algunos
blastómeros
2. Embrión en fase blastocisto:
se recogerán fibras del
trofoectodermo
Técnicas:
1. ESTUDIO DE CARIOTIPO.
- Para conocer el sexo
- Elevado nº de cel necesario
- Las células recogidas se
encontrarán en una
fase específica de ciclo
celular
- Se para la fase
- Ordenar los cromosomas
según el número de
la especie
- XX y XY
- PCR.
- Se determinan fragmentos
especif. del ADN del
cromosoma - Menor nº cel necesarias
- Los blastómeros sometidos a
una reacción electroforética
-> desplazamiento de las cél
al ser sometidas a un campo
magnético. - Los machos dibujan un
patrón de bandas que en
hembras aparece ausente.
- Se determinan fragmentos
- HIBRIDACIÓN IN SITU.
- Menor nº cel necesarias
- Se emplea para la
localización, detección y
marcaje
- Mediante tinciones
fluorescentes de secuencias
de ADN concretas.
- Cromosoma Y con
fluorescencia verde ->
aparecerá mayor
fluorescencia machos >
hembras en estas
regiones de ADN.
Nº células: cariotipo > PCR > hibridación in situ
- DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
-1.2 DETERMINACIÓN DEL
GENOTIPO
Utilidad a la hora de seleccionar embriones portadores de genes de interés a nivel de producción de carne o de leche
Microsatélites: aquellos genes asociados a determinados caracteres productivos. Son moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido.
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.1 ¿ Por qué se usa?
No interviene el macho ni la hembra
Se una x las limitaciones de la producción in vivo:
1. Embriones transferibles x
recogida : como max imposib
de subir 6/superovulación
(baja rentabilidad)
- Algunas hembras no
responden a los ttos y es
necesario respetar un
periodo de descanso
3.Baja frecuencia y necesidad de un tracto genital perfecto de las donantes
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.2 Aplicaciones
- Aumentar el rendimiento de los programas de producción de embriones
- Permite utilizar hembras en
situaciones fisiológicas
diversas
- Evita la necesidad de
emplear gonadotropinas - Se obtiene un número mayor de embriones y con menor coste
- Recuperar la genética de las hembras de sacrificio obligatorio
4.Aumenta el aprovechamiento reproductivo de los animales infértiles
- Hembras prepúberes tb son candidatas a ser donantes de ovocitos (incluso de ovarios fetales)
- Animales infértiles por alteraciones uterinas y oviductales son útiles para la producción de ovocitos
- Producción de embriones a partir de folículos primordiales
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.3 Uso comercial
- Bajo rendimiento (30-40%)
- Embriones de - calidad, y con -
potencial de desarrollo (30-
40%) - +incidencia de mortalidad
embrionaria, abortos y
patologías gestacionales
(hidroalantoides) q in
vivo - La incidencia de distocias por exceso de volumen fetal también es mayor
- Nacimiento de fetos muy voluminosos, con anomalías y
menor vigor - Gestaciones más prolongadas
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
- Obtención de ovocitos
- Selección
- Maduración in vitro hasta
metafase I (fecundables) - Fecundación in vitro
- Cultivo hasta estadíos
transferibles a vacas en
día 7 - 7.5 de ciclo (mórula o
blastocistos)
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
2.4.1 Obtención de ovocitos (sacrificados y vivos)
Técnicas para animales sacrificados
1. Se meten ovarios en solución salina calentada a una Tª similar a la corporal para llevarlos a lab
- Se extrae el contenido de todos los folículos siguiendo la técnica deseada
- Disección folicular
- Punción folicular
- Fileteado del ovario
- Slicing
- Digestión enzimática
- Lo + Frec: punción folicular o
el slicing -> cortes con
el bisturí sobre toda la
superficie + lavado
después para extraer todos l
os ovocitos
Técnicas para animales vivos
Reducido nº de veces q se extraen x requerir
técnicas quirúrgicas:
- Laparotomía (ovariectomía)
- Laparoscopía
- Aspiración transvaginal
ecoguiada (OPU) -> en
ovarios grandes NO
prepúberes
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
2.4.2 Selección
Se seleccionan los ovocitos en función de:
- CÉLULAS DEL CÚMULO
(también conocido como
complejo cúmulo-ovocito)
- Necesaria una buena
capa de cel del cúmulo
para saber q está
maduro
- Los ovocitos envejecidos
tienen las células
dispersas y centros con
pignosis - ASPECTO DEL CITOPLASMA: granular y heterogéneo
- DIÁMETRO DEL OVOCITO (> 110 micrómetros) -> +diámetro mejor ovocito
Factores de condicionan la calidad:
- Fase del ciclo estral de la hembra
- Ausencia de un FD
- Diámetro de los folículos
- A mayor diámetro mayor
competencia
- Edad de la hembra
- PREPUBER BEST
- Adulta
- Edad Avanzada
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
2.4.3 Maduración
- Ovocitos en estufa en un medio de cultivo en forma de microgotas -> gotas metidas bajo aceite de parafina para:
- Mantener el volumen
pequeño - Concentrar los factores
paracrinos - Mantener estables las
variables de temperatura,
humedad y atmósfera
gaseosa ( CO2 tiene
efecto tampón (f(x) ->
mantener el pH estable))
- Mantener el volumen
- El medios de cultivo + usado es el medio de cultivo celular (TCM) combi con sust q promueven maduración
- Cambios en el ovocito que SUGIEREN MADURACIÓn:
- Expansión del cúmulo
- Aumento del espacio
previtelino - Expulsión del 1º corpúsculo
polar (fin meiosis I)
- Las células del cúmulo secretan enzimas proteolíticas que aumentan la laxitud entre las uniones celulares
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
2.4.4 Fecundación
Lo + habitual es usar semen congelado -> Problem
- Contiene como diluyentes
algunos elementos
que dificultan el proceso de
FIV si se introducen
en la gota de fecundación
- Gran parte de los
espermatozoides destruidos
en congelación y liberan
enzimas proteolíticas
de degradación si intros al
ovocito
Preparación del semen
1. Descongelar
2. Separación de los espermatozoides
- Tecnica Swim up
- Gradiente discontinuo de
percoll
* Se separan del liq seminal y
se agrupan en función de
su movilidad y morfología
3. La concentración introducida debe ser de 1000 espermatozoides/ovocito
- En un = medio de cultivo (cocultivo) introducen los ovocitos maduros y los espermatozoides con
motilidad ( 6-20 h y = condiciones q maduración) - Se añaden distintas sustancias para favorecer la capacitación y motilidad de los esp
- ¿Espermat escasos? : Inyección intracitoplásmica de espermatozoides (en eq siempre se usa)
- Ovocito sufre una serie de cambios estructurales (Células del cúmulo desaparecen): INDICADORES DE FECUNDACIÖN
- Presencia el 2º Corpúsculo
polar al completarse la
METAFASE II - ID de espermat accesorios
alrededor de la corona
pelúcida - ID de 2 pronúcleos 1masc y
1fem - ID de segmentación
- Presencia el 2º Corpúsculo
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.4 ¿ Cómo se hace?
2.4.5 Cultivo
Es una fase de evolución del cigoto hasta alcanzar los estadios transferibles
1ºSe convierten en mórulas
2º Sufren el proceso de
compactación
3º Se forma el blastocele y la
masa celular interna
4º Eclosiona la zona pelúcida
Medios de cultivo
- Simples
- Complejos: suplementados con macromoléculas, células somáticas, quelantes o citoquinas
- PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
2.5 Evaluación de calidad
- Obtenido el embrión
evaluamos:
- Estadío de desarrollo adec
- Esfericidad
- Homogeneidad
- Nº cel
- Densidad de cel - Métodos de evaluación Invasivos:
- Se basan en teñir los núcleos y
contar el nº de cels que tiene el
blastocisto
- A mayor número de células,
mayor calidad; en el proceso
de evaluación el embrión
muere pero nos permite
estimar la calidad media
TABLA
In vivo
- Tª cte
- Oscuridad total
- Presiones de O2 y CO2 controladas
- Peq vol de secreciones genit rodeando embrio
- Medio dinámico con continuos cambios de compo
In vitro
- Tª no cte
- Luz diurna y microscopio
- Presiones de O2 y CO2
fluctuantes
- Gran vol de secreciones genit
rodeando embrio
- Medio dinámico con excesos o defecto
- CLONACIÓN (Que es y aplicacioens?
Proceso de obtención de varias copias de un mismo individuo, idénticas desde el punto de vista genético
APPS
1. Permite evaluar capacidades de adaptación del fenotipo dependiente del ambiente
- Mantenimiento de la biodiversidad al ser una herramienta de construcción de criobancos de células somáticas obtenidas de razas en peligro de extinción
- El problema es que este
tipo de animales necesitan
controles estrictos,
inducciones de parto y
control a posteriori - En investigación y como productos comerciales
- Pueden clonarse animales aplicando edición génica, es decir, modificando su genoma.
- CLONACIÓN
3.1 Métodos de clonación : Bisección embrionaria
- Con una cuchilla microscópica de vidrio, se separa en dos un estadio de mórula
- 1 d las partes se introduce en una zona pelúcida vacía y se transfiere cada embrión a una
receptora - +nº de cortes -> probab hay de que ese individuo salga adelante
