Tema 4: PRODUCCION DE EMBRIONES IN VIVO (Ru) Flashcards
¿Que es la transferencia de embriones?
Transferencia e implantación de embriones de vacas de elevado potencial genético (hembras donantes) al útero de vacas de menor potencial genético (hembras receptoras)
Requisitos para las hembras donantes
SANITARIOS
(1) SANITARIOS
- Explotación y animales libres de aquellas enf infecciosas transmisibles controladas por las campañas de erradicación:
- Brucelosis
- Tuberculosis
- Leucosis
- Perineumonía
- Desparasitación 2 meses previo a la superovulación
- No presentar patología que afecte a los resultados
Requisitos para las hembras donantes
GENÉTICOS
(2) GENÉTICOS
- Mejores índices genéticos
- Seleccionar los caracteres de mayor importancia $
- Vacuno de carne y leche:
- Cantidad y calidad de los productos
- Duración de la vida productiva
- Nº de cel somáticas
- Descartar animales portadores de :
- Enf transmisibles
- Carácter culón en carne
- Enf asoc a genes recesivos
Requisitos para las hembras donantes
NUTRICIONALES
- CC >2.5
- Alimentación adecuada a su estado productivo
- Evitar excesos o deficiencias nutricionales
- Si existe déficit de energía
- Menor resp ovárica
- Menor nº de embriones transferibles
Requisitos para las hembras donantes
REPRODUCTIVOS
- Antecedentes de buena fertilidad y fecundidad
- Funcionalidad ovárica normal -> haber tenido 3
celos a intervalos regulares y normales - Transcurridos min 60 días desde ultimo parto (óptimo 90 - 150) para garantizar invol uterina
- Multíparas: mayor resp ovárica + mayor
mortalidad embrionaria - Nulíparas : menor resp ovárica + menor
mortalidad embrionaria - Mínimo 40 días transcurridos desde tto anterior
de super ovulación - Examen clínico del aparato genital
- No lesiones vaginales
- No infección uterina
- Tamaño normal de los cuernos y cervix
- No alteraciones ováricas
- No adherencias
MANEJO DE HEMBRAS DONANTES
**Podemos obtener embriones desde que la vaca entra en la pubertad, no requiere CC concreto ni un desarrollo completo
- En explotaciones de origen
1.1 Más económico
1.2 Rigurosidad en la detección
de celo y admin de hmnas
( x el ganadero)
1.3 Instalaciones específicas
1.4 Difícil programación y nº de
desplazamientos a la expl. - Agrupamiento en centros de
transferencia de embriones
2.1 Contagio de enf entre
vacas de distintas explo
2.2 Facil admin hmnas, control
del celo y planif del trabajo
2.3 Mejores resultados
Hembras receptoras
¿cual es la mejor opcion?
- Condiciones sanitarias
óptimas - Normalidad estructural y
genital - Adaptadas al ambiente ->
Rústicas - 1ª Opción: novillas vírgenes de
15 - 18 meses con buen
desarrollo corporal - 2ª Opción: Vacas de segundo
parto
¿Por qué se utiliza la transferencia de embriones?
Existen una serie de factores que limitan el progreso genético en el ganado bovino:
- Tiempo entre partos consecutivos
- Baja tasa reproductiva (1/2 descendientes al año)
- Prolongado intervalo generacional
Objetivos de la transferencia de embriones
1- Aumentar el numero de descendientes obtenidos de las hembras de mayor valor genético
2- Acortar el intervalo generacional
¿Qué es superovulación?
Proceso de estimulación ovárica que se realiza con el fin de obtener ovulaciones múltiples a partir de vacas donantes de ovulación simple.
Dentro de la actividad de la producción de embriones:
- PRODUCCION IN VIVO: se recuperan embriones vivos de vacas donantes y se transfieren a vacas receptoras
- PRODUCCION IN VITRO: se recuperan ovocitos de vacas donantes, se fecundan in vitro y se implantan en vacas receptoras
+ Habitual in vivo : 6 embriones / recogida (poco)
El sexaje y el genotipado de los embriones comenzó a realizarse al introducirse la técnica de
MICROMANIPULACIÓN DE EMBRIONES
¿QUÉ ES UN EMBRIÓN?
En embriología y reproducción: Tras completarse el proceso de fecundación y hasta el momento final de la organogénesis hablamos de embriones
Transferencia de embriones: Los estadios de desarrollo recuperables y transferibles con
facilidad (desde la fase de mórula hasta la de blastocisto, incluida). Para que esto ocurra, el embrión debe estar en el útero pero no puede haberse implantado.
APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES E INCONVENIENTE
1- Mejora Genética:
- Selección de indv en f(x) del
fenotipo
- Reduce el intervalo
generacional
- Permite aumentar la
producción de sementales
- Fomenta la conservación ex
situ
2- Control de enfermedades
(mayoría de IA/monta)
3- Facilita el intercambio de
animales entre zonas
geográficamente alejadas
Inconvenientes:
- Disminuye la variabilidad
genética (obj ppal es reducir el
nº de ppantes en proceso
reprod)
- Aumenta los problemas
reproductivos asoc a la
consanguinidad
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? Pasos generales
- Elección de donante
- Superestimulación ovárica
- Ovulación
- Inseminación
- Recogida y evaluación de embriones
- Embriones en medios adecuados
- Transferencia embrionaria a hembras receptoras
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : SUPERESTIMULACIÓN DE LA FUNCIÓN OVÁRICA DE HEMBRAS DONANTES
Consiste en aumentar el nº de ovocitos fecundados y de embriones transferibles producidos con capacidad suficiente para producir o continuar las gestaciones.
Convertimos animales de ovulación simple -> ovulación múltiple
Proceso:
1. Admin sust con capacidad
para estimular el crecimiento
folicular (actividad FSH) e
inducir la luteólisis (en la
etapa + favorab d la oleada)
2. Tras la lisis los folículos
dominantes se convierten en
folículos preovulatorios
3. Se liberan los ovocitos
fecundables al oviducto
¿QUÉ HORMONAS SE USAN EN LA SUPEROVULACIÓN?
(1) Para la estimulación del crecimiento folicular
A. GONADOTROPINA
CRORIÓNICA EQUINA (eCG)
- Dejó de emplearse por su
prolongada vida media
(40h)
- Proporciona grandes
cantidades de ácido siálico
y reduce el número de
inyecciones a administrar
(1 inyección)
- Durante esas 40 horas de
efecto es capaz de estimular
variar oleadas de
crecimiento
- Al crecer nuevos folículos
oleada tras oleada, se elevan
los estrógenos y empieza a
subir la P4
- Buenas resp pero bajo nº de
embriones transferidos
B. FSH
- Duración 5h
- Vida corta ( 2 inyec/ dia 4-7d)
- Viene del ganado porcino
C. GnRH/hCG : para sincronizar
folículos y ovulación de
los folículos dominantes
D. P4: se combina para generar
un ambiente óptimo durante
el crecimiento
(2) Para inducir la luteólisis: PGF2 alfa (aparición de
celo en 36 a 48 h)
SUPEROVULACIÓN: TTO x pasos y su problema
- Comienza a mitad de ciclo (8 -
12 d) - Escoge 1 opción
2.1 1 dosis eCG
2.2 8 dosis de FSH (intervalos
de 12h) - 3 - 4 días después : PGF2 alfa -> lisis de CL
- Detección de celo
- Insem a las 12 - 24h de su inicio
Problema:
- Tasa de respuesta no suele ser homogénea
- % respuesta alta (ttadas cdo
no habia CL en el ovario)
- % respuesta baja (ttadas cdo
SÍ lo habia)
- % NO RESPUESTA
Factores endógenos EN LA SUPEROVULACIÓN
- Edad
- Partos
- Raza
- Situación folicular
4.1 Nº de folículos antrales que
estén presentes en el
ovario en el momento de
inicio de tto
4.2 Presencia / ausencia del FD - Situación lactacional ¿Cuándo momento óptimo para la superovulación?:
5.1 Una vez superado el pico
de lactación
5.2 Cuando aumenta la CC
5.3 Cuando se invierte la curva
del balance energético
balance energético positivo
Factores endógenos: SITUACIÓN FOLICULAR
- El número de folículos ≥ 3 mm muy variable entre indv (6 – 56) influyendo en la respuesta al
tratamiento. - La secreción endógena de gonadotropinas es inversa al
número de folículos antrales en crecimiento.
3.Cuando el tratamiento se inicia sin conocer la etapa de la
oleada puede coincidir con la presencia de un folículo
dominante
Factores exógenos EN LA SUPEROVULACIÓN
- Características de las Hormonas
1.1 Mezcla LH y FSH f(x) > solo
FSH
1.2 FSH >eCG (xq da + embrios
viables) - Protocolo de administración
(defin x):
2.1 Dosis total administrada
2.2 Duración de tratamiento si
se realiza con FSH
2.3 Intervalo entre admin de
gonadotropinas y la
aparición del celo - Alimentación
- Manejo
- Estación
SUPEROVULACIÓN: PROCEDIMEINTOS PARA MEJORAR LA RESPUESTA
- Inducir atresia folicular antes
de tto (con estrógenos y P4) - Suprimir folículo dominante
para garantizar empezar el
protocolo con una nueva
oleada ¿cómo?
2.1 Punción y aspiración del
contenido
2.2 Provocando ovulación
GnRH - Favorecer reclutamiento (FSH
7 días) - Tto d hembras con actividad
ovárica anormal - Tratamiento durante el inicio
de la oleada de crecimiento
folicular
5.1Detección de celo
5.2 Sincronización de la
ovulación
PROTOCOLOS PPAL Y ALTERNATIVO:
PPAL
1) 9 días tras ap celo (nat o
induc) -> exploramos ov en
busca de FD
2) Suprimir FD con punción aspir
-> iniciar nueva oleada
3) 2 días después -> eco para ver
nº folic
4) FSH BID 4 días
5) a los 3 fías (24h antes de
acabar -> pgf2 -> lisis CL y ovul
6) en las sig 24 y 48h se detecta
celo e IA ITF (sin detect celo IA
7) ITF (sin detect celo) IA a las 48
y 72h
8) sobre el día 23 lavado uterino
y recoger embrios
PROTOCOLOS PPAL Y ALTERNATIVO: ALTERNATIVO
1) Inicio: pgf2 (luteolisis) + Disp
P4 hasta día 12
2) 7d tras inicio: GnRH para
luteinizar FD o q ovule y se
forme un CL
3) día 9 tras inicio: empezamos
FSH BID 4 días
4) Dia 10 o 11: 2 inyec (cada
12h) pg
5)Dia 13: GnRH
6) Día 14: Doble IA BID
7) Día 20: lavado uterino
y recoger embrios
SUPEROVULACIÓN: PROCEDIMEINTOS PARA SIMPLIFICAR EL TTO
- 1 sola admin de FSH via SC
- 2 admin FSH via SC en los animales menos sensibles a estrés x manejo
- Formulas comerciales
- Combinación de FSH - Polímeros biodegradables
- Combinación de FSH - eCG
**Resultados suelen ser peores pero si dificil manejo para poner 8 inyecciones a intervalos de 12h es lo q hay
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? :
1)Superovulación
2)DETECCIÓN DEL CELO E INSEMINACIÓN
3) Recuperación de embriones
4) Transferencia de embriones
5) Conservación de embriones
- Extremar la vigilancia
1.1 La vacas sometidas a
superovulación tienen
menos s. de celo
1.2 10% hembras no lo
manifiestan - Antes de inseminar
2.1 Comprobar la calidad del
semen
2.2 2 inseminaciones
consecutivas
- 1º a las 12h del inicio celo
- 2º a las 24h del inicio del
celo
Recuperación de embriones:
NO QX: desde el ÚTERO
QX: desde el OVIDUCTO
se prefiere el menos invasivo
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : Recuperación de embriones (Pasos del proceso NO QX)
Método NO QUIRÚRGICO: Buscan recoger embriones que ya hayan completado su migración desde el oviducto al ÚTERO
- Momento de la realización
- Preparación de la donante
- Material y medios necesarios
- Objetivos de la recogida
- Búsqueda y selección
- Lavado de embriones
- Manejo
Recuperación de embriones: Momento de la realización
- A partir del día 4.5 - 5 desde
inicio celo : embriones en el
útero - A partir del día 6.5 - 7 : La
mayoría de los embriones son
mórulas muy compactas o
blastocitos (soportan mejor la
críopreservación) - A partir del día 7.5 - 8: gran
parte de los embriones han
eclosionado (no viables)
Recuperación de embriones: Preparación de la donante
- Inmovilización en potro de
contención - Tranquiliz con xilacina +
lidocaína epidural (reduc
motilidad intrapélvica) - Cola fijada lateralmente
(facilitar limpieza y
desinfección zona perineal) - Manipulación del útero:
elevando parte anterior 30 - 35
cm y manteniendo rumen
lleno - Palpar ovarios para evaluar
calidad de respuesta ¿FD o CL?
-> repuesta menor
Recuperación de embriones: Material y medios necesarios
MATERIAL
- Estéril y NO reutilizable
- 1º Cateterizamos cervix con la
sonda e inflamos el balón de
fijación contra la pared
- Objetivo: crear un
compartimento estanco y que
el líquido solo tenga la vía de
salida que emplearemos
para recoger los embriones
- Proceso actual: Colocar el balón en cuerpo craneal al cuello y mover el líquido con la mano hasta cada uno de los cuernos
MEDIOS
1. Medios isotónicos con
surfactante y tamponados
para mantener el ph
2. RL con %BSA
3. Medios isotónicos con suero
fetal o alb sérica
Recuperación de embriones: Objetivos de la recogida
- Lavado efectivo
- Liq debe alcanzar el 1/3
superior del cuerno
-Recuperar la totalidad del líq
inyectado (el nº de
embriones dependerá del
vol de líq recuperado)
- Liq debe alcanzar el 1/3
- Que no provoque lesiones
endometriales- Ajustar muy bien el vol que
introducimos en base a las
proporciones de las
dimensiones del tracto
genital
- Ajustar muy bien el vol que
Recuperación de embriones: Búsqueda y selección
A. Observando una placa que
contenga unos pocos ml del
líquido extraído en la lupa
A.1 Lo pasamos x filtros y [] a
vol pequeños
B. International Embryo Technology Society (IETS): manual de clasif de embriones según CALIDAD y ESTADÍO (en base a eso se asigna un código de nº y letra)
- ESTADÍO
1. Ovocito
2. 2 - 16 cel
3. MORULA JOVEN
4. MORULA COMPACTA
5. BLASTOCISTOJOVEN
6. BLASTOCISTO
7. BLASTOCISTO EN EXPAN
8. Blastocisto eclosionado
- CALIDAD (esfericidad,
simetría y nº cel agrup (dctm
ppal))
a. Clase 1:transferible y
congelable
* esférico y simetrico +
blastomeros uniformes
\+ zona pelucida intacta +
masa embrionaria viable
con poco espacio
perivitelino
b. Clase 2: transferible y NO
congelable
*minimo 50% mat cel
normal
C. Clase 3: NO transferible y
NO congelable
d. Clase 4: degenerados
Recuperación de embriones: Lavado de embriones
- Lavado y descontaminación
bacteriana - Dilución de los embriones
pasándolos por distintas
placas con la misma solución
que la del lavado (los 1º tienen
tripsina y se va eliminando) - Objetivo: evitar la
contaminación vírica al romper
adherencias de las células del
cúmulo
Recuperación de embriones: Manejo
¿pajuelas? ¿conservacion?
- Los embriones se envasa en pajuelas similares a las que se usan para IA
- La transferencia se hace en fresco o pueden emplearse métodos de conservación como la congelación lenta o la vitrificación
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? Transferencia a receptoras
- Transferencia quirúrgica
- Transferencia no quirúrgica
- Sincronización
- Transferencia en fresco:
sincronizar con el celo de la
donante - Embriones congelados: celos
naturales o inducidos
- Transferencia en fresco:
Mejor técnica: novillas con embriones FRESCOS mediante transferencia QUIRÚRGICA
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : TRANSFERENCIA NO QX
- La vaca debe estar en DIESTRO ( en IA en fase de estro o inicio de metaestro)
FASE DEL DIESTRO: Día 7 tras el estro , el día del ciclo que conduerde con el estadío del embrión.
Cuando el cuello uterino esta CERRADO y el moco denso dificulta su cateterización
METODO NO QUIRÚRGICO
- Vía transcervical
- Día 7 del ciclo (sincronía > 24h)
- Exploración previa de en q cuerno esta el CL
- Depositar embrión en la zona media del cuerno IPSILATERAL al CL (al cuerno q no tiene CL)
- Depende de FACTORES
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : Factores que influyen en la tasa de gestación
1. Receptoras
- Situación endocrina
- Nº de transferencias sobre la
receptora ( + nº -> - %
gestación) - Edad / Nº de partos (novillas o
vacas de 2 - 3) - Raza (rústicas sufren menos
estrés)
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : Factores que influyen en la tasa de gestación
2. Dependientes de la técnica
- Lugar de colocación ( 1/3 cr del cuerno ipsilateral al CL)
2.Destreza del operador
3.Duración de la transferencia (manipulaciones largas -> inflamación y difícil inicio gestación)
4.Esterilidad del proceso
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : Factores que influyen en la tasa de gestación
3. Dependientes del procedimiento de conservación
- Recogida - congelación
(cuanto menor sea este
intervalo + % gestación) - Calidad del embrión tras la congelación - descongelación
3.Indv de procedencia (vaca-toro)
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
Corto plazo:
- Menos de 12 h si se
mantienen los embriones a
Tª ambiente
- 12-24 h si se mantienen en
refrigeración a 4ºC
Largo plazo:
- Congelación / Vitrificación
- Conservan ANTES de haber
transcurrido 2h desde la
recogida
Métodos:
- Congelación
- Descongelación
- Vitrificación
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
CONGELACIÓN
**Reducir Tª de forma lenta y progresiva
1. Evitar la formación de cristales de hielo de GRAN TAMAÑO que rompan las mb cel
- Enfriamiento a bajas velocidades en el que se añaden bajas [crioprotectores] (8 - 10%)
3.Pasos
1) Periodo de equilibrado (5 a
10 min al aire libre
para q se adapte a la Tª
ambiente)
2) Descenso a punto
crioscópico de la solución:
(-5º o -9 º)-> empieza a
congelarse
3) Inducción a la cristalización
“ seeding” : evita
reacción exotérmica en la
que el embrion se congela
y al mismo tiempo libera
calor
4) Enfriamiento lento : Bajar Tº
hasta los -33º o - 40º a una
vel de 0.3 - 0.6 ºC / min
5) Inmersión en N líquido (- 196º)
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
CONGELACIÓN
Ventajas e inconvenientes
Ventajas
- Laboratorios venden medios comerciales (muy estandarizado)
- Fácil de aprender
Inconvenientes
- Caro (requiere congeladorprogramable)
- Requiere tiempo
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
DESCONGELACIÓN
POR ETAPAS
1. Sacar pajuela dele estanque y
calentar a 30 º 30 s
2. Secar la pajuela y vaciar el
contenido en sol de
crioprotector + sacarosa
3. Lavados de 5 min en
soluciones de [ ] decrecientes
de crioprotector y cte de
sacarosa
4. Lavar en una cuarta solución
de PBS para rehidratar el
embrión
5. Evaluar calidad e introducción de la pajuela
EN UNA ETAPA (sin sacar al embrión)
1. Se coloca el embrión en un
pequeño volumen en la parte
media de la pajuela
2. Se le rodea por otro pequeño
volumen, en los extremos, de
crioprotector y sacarosa
3. Se pega un golpe a la pajuela
para que se mezclen ambas
partes
4. Descongelar a 37º
5. Inmediatamente después
transferimos el embrión, por
lo que la rehidratación se
completa en el útero
6. Simplifica el proceso pero
peores resultados
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
VITRIFICACIÓN
*Inducción de una viscosidad extrema en la solución de manera que impida la formación
de cristales de hielo tanto a nivel intra como extracelular.
- Es un proceso de enfriamiento a VELOCIDADES ELEVADAS y a ELEVADAS [CRIOPROTECTOR PENETRANTE]
- Debemos buscar la [ ] de crioprotector no toxica para el embrión y eficaz
- Reducir las dosis de
crioprotectores añadiendo
etilenglicol + galactosa
- Reducir las dosis de
- Impide la formación de
cristales de hielo - Tiempo de equilibrado es muy
reducido + enfriamiento
ultrarápido indtrod pajuelas
directm en N líquido (vel
descenso de 250ºC/min) - Desvitrificación es también
muy rápida y casi instantánea - Factores que condicionan resultado:
- Velocidades de enfriamiento
y calentamiento - Viscosidad del medio
- Volumen
- Velocidades de enfriamiento
- Sistemas : abiertos ( introd al embrión contactando directamente con el N líquido-> “media pajuela” o “vitrificación directa”) o cerrados -> “ punta pipeta” o “pipeta sellada”
¿CÓMO SE REALIZA LA TÉCNICA DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES? : 5) Conservación de embriones
VITRIFICACIÓN
Ventajas e inconvenientes
Ventajas
- Muy rápido
- No se necesita comprar nada
Inconvenientes
- No estandarizado
- Requiere entrenamiento
(transferencia en máximo 20-
30”)
- Menos útil en campo
