Teknik Kultur Protoplas dan Pemanfaatannya untuk Perbaikan Genetik Tanaman

Question 1

Dinding Sel mengandung 3 lapis:

Answer 1

1) Lamela tengah
2) Dinding primer
3) Dinding sekunder

Question 2

Lamela tengah: Lapisan pertama yang
dibentuk saat (1), mengandung
senyawa ()2.

Answer 2

1. sitokinesis
2. pectic dan protein

Question 3

Dinding primer: Segera dibentuk setelah lamela tengah,
mengandung skeleton yang rigid dari mikrofibril (1) yang tertanam pada matrik yang mengandung senyawa (2).

Answer 3

1. cellulose
2. pectic, hemicellulose, and glycoproteins

Question 4

Dinding sekunder: Dibentuk setelah pembesaran sel selesai, sangat kaku dan memberikan kekuatan terhadap tekanan, terbuat dari …

Answer 4

cellulose, hemicellulose and lignin

Question 5

Totipotensi protoplas tumbuhan in vitro contohnya pada kultur

Answer 5

protoplas alfafa (Medicago sativa)

Question 6

Bahan isolasi protoplas tumbuhan

Answer 6

Syarat:
 Jumlah sel banyak
 Sel relatif seragam
 Enzim mudah sampai ke dinding
sel
 Tidak mematikan tanaman

terutama ada di daun (Sel-sel Mesofil) dan Kultur Suspensi Sel

Question 7

Bagaimana mengisolasi protoplas tumbuhan?

Answer 7

 Metode mekanik
 Metode enzimatik (Pectinase dan Cellulase)

Question 8

 Metode mekanik

Answer 8

Jaringan tanaman (khususnya daun ) ► plasmolisis sel ► pengamatan
sel di bawah mikroskop ► pemotongan dinding sel dengan skarpel
►protoplas akan lepas/keluar ► mengkoleksi protoplas

Question 9

 Kelemahan metode mekanik

Answer 9

 Hanya untuk sel dengan vakuola besar, misal
onion bulb scale, radish and beet root tissues
 Protoplas yang dihasilkan sedikit
 Prosesnya sangat menyita tenaga dan perlu
keahlian khusus
 Viabilitas protoplasnya rendah

Question 10

 Metode enzimatik
 Pre-enzyme treatments:

Answer 10

 mendegradasi lamela tengah dan mengurai selulosa pada dinding sel (Pectinase dan Cellulase)

 untuk memfasilitasi agar penetrasi
larutan enzim ke dalam ruang antar
sel-sel daun (misal: cacah daun,
vacuum, agitasi, enzim cutinase)

Question 11

Freshly isolated protoplasts example

Answer 11

Medicago sativa (Mesophyll)
Brassica napus (hypocotyl)

Question 12

1. Protoplas sangat … terhadap tekanan osmotik
2. Perlu tekanan osmotik yang cocok (isotonik) dan juga harus stabil (Osmotika umum: …)
3. Ditandai dengan protoplas hasil isolasi berbentuk …

Answer 12

1. fragile
2. Sorbitol dan manitol ~ 450-800 mmol
3. bulat sempurna

Question 13

1. Bagaimana bila tekanan osmotik tidak cocok?
2. Pada proses dan dimana osmotikum penting?

Answer 13

1.  hipotonik: protoplas lisis /pecah (pada sel utuh→turgid)  Hipertonik: protoplas terjadi plasmolisis
2.  Larutan enzim
    Medium pencuci/pembilas saat isolasi
    Medium kultur protoplas

Question 14

Purification of protoplasts
 Setelah inkubasi perlakuan enzim, potongan daun dalam larutan digoyang-goyang agar …
 Saringan nilon (30-100 µm) digunakan untuk …
 Filtrat disentrifuse pada … dan diambil …
 Pellet selanjutnya dicuci dengan medium pencuci dan disentrifuse pada …
 Selanjutnya pellet protoplas dihitung jumlahnya menggunakan … untuk selanjutnya dikulturkan pada … yang dikehendaki

Answer 14

 protoplas keluar/lepas
 untuk memisahkan protoplas dari sebagian besar bagian lain yang tidak diperlukan
 100 x g untuk 5 min dan diambil pelletnya
 50 x g untuk 3-5 min.
 hemasitometer, densitas

Question 15

Flow diagram
for the
isolation of
mesophyll
protoplasts

Answer 15

Liat PPT

Question 16

Metode untuk pengujian viabilitas protoplas

Answer 16

1) Pengamatan dengan mikroskop phase kontras: ada nucleus dancytoplasmic streaming yang mengindikasikan metabolisme aktif.
2) Aktifitas respirasi: Tetrazolium → formazan (merah) → ukur denganspectophotometer
3) Pewarnaan Evan’s blue: → hanya masuk ke dalam sel yang rusak, dan tidak untuk sel yang utuh dan viabel
4) pewarnaan dengan fluorescein diacetate(FDA): → mati tidak fluoresensi; →hidup fluoresensi

Question 17

Flow diagram for the culture of protoplasts

Answer 17

Liat PPT

Question 18

Nurse culture of rice protoplasts

Answer 18

Protoplas ditanamkan dalam blok agarosa nutrisi dan disuspensikan dalam media cair yang mengandung sel perawat.