Tecniche di Spettrofotometria Flashcards
A cosa servono le tecniche di spettrofotometria?
A quantificare la concenrtazione di un composto specifico in una miscela. Si basa sul principio che le molecole sono quantizzate: assorbono la luce a un’esatta lunghezza d’onda (energia), che colpendo la molecola causa transizioni degli elettroni: fa fare salti energetici a elettroni esterni per passare da uno Shell a uno stato eccitato più elevato
Come fa lo spettrofotometro a capire la concentrazione?
L’assorbimento di energia è usato dallo spettrofotometro per capire la concentrazione dell’analita nel composto. Ogni composto chimico ha una sede caratteristica tipica di ogni moelcola: solo quel composto può assorbire la luce a una specifica lunghezza d’onda e produrre segnali (spettri) indici solo di quella molecola e direttamente proporzionali a una intensità che estrapolata in una curva di calibrazione dà segnale della quantità presente.
Che vuol dire lavorare nell’assorbanza?
L’assorbanza è la luce visibile. Lo spettrofotometro spacchetta ogni singola lunghezza d’onda, come succede quando c’è l’arcobaleno. Ogni colore è dato dal fatto che ha una lunghezza d’onda diversa.
Quali sono i 4 componenti fondamentali di uno spettrofotometro?
la sorgente, il monocromatore, il portacampioni e il cronometro.
Cosa fa il monocromatore?
Ha la funzione delle gocce d’acqua: divide le lunghezze d’onda e ne amplifica la loro distinzione. Lo fa tramite prismi di quarzo o reticoli di diffrazione. Il reticolo di difrazione fa sì che quando il fascio lo colpisce, lo riflette cambiandone l’angolo, separando meglio la lunghezza d’onda.
Su quale legge si basa l’uso dello spettrofotometro?
Quella di lambert berer: la trasmittanza è il rapporto tra raggio uscene e raggio incidente. Conoscendo i parametri, si può determinare la concentrazione tramite la formula trasformata della legge di lambert-beer.
Perché alcuni spettrofotometri hanno due portacampione?
in uno si mette il bianco: componenti della soluzione in cui l’analita è contenuto. Lo strumento a doppio raggio fa passare il fascio nel bianco e nel campione: i due fasci sono rilevati da una lente che unisce i fasci e li sottrae così il valore di intensità del raggio uscente è dato dalla capacità di assorbire e deviare energia del composto di interesse.
Lo spettrofotometro può fare misura diretta e indiretta. come funziona la indiretta?
Nella indiretta si aggiunge un colorante che interferisce con le proteine: quanto più la soluzione è colorata (proporzionalmente alle proteine) quante più molecole sono presenti. Per i metodi indiretti si aggiunge per esempio il Biureto, il Folin-Lowry etc.
A cos’altro serve lo spettrofotometro?
per determinare la purezza del dna e rna in seguito a estrazione di acidi nucleici, es come si fa nello stool test.
Ogni buffer usato potrebbe portarsi dietro contaminanti che potrebbero influenzare la purezza del dna. Ogni volta che estraggo il dna allora devo leggerlo allo spettrofotometro per determinarne la purezza.
Di solito si usano 280 (dna ha max assorbanza), 260 (rna, proteine)e 230 (contaminanti)
Cosa dice il principio di frank-condon?
Che non cambia la posizione degli atomi nella molecola durante la transizione, ma è uno stato transiente e non permanente. La fluorescenza permane meno della fosforescenza.
Quali composti danno fluorescenza?
di solito gli aromatici (i composti del benzene), ma anche NADH, FAD e fenilalanina
