Fase preanalitica: estrazione, purificazione, arricchimento etc

Question 1

Come estrarre le proteine da un tessuto o campione?

Answer 1

La prima cosa è scegliere il buffer: nello stool test per esempio, le feci vanno sospese: serve il buffer ideale a seconda di cosa va cercato. Per proteine nel cervello o osso: bisogna disgregare il tessuto solido, quindi prendendo le cellule per poi studiarle etc. Per recuperare una proteina serve evitare di inserire agenti denaturanti (temperatura, ph di solito, fattori ossidanti es radicali ossigeno e fattori precipitanti es tannini). Si aggiunge poi un cocktail di inibizione delle proteasi.

Question 2

Dopo aver estratto le proteine dal campione, come si procede?

Answer 2

Si fa una centrifugazione

Question 3

Cosa contiene un cocktail per la lisi cellulare?

Answer 3

inibitori delle proteinasi, EDTA per bloccare i radicali, poi di solito si lavora in ghiaccio, detergenti per rompere la membrana cellulare lipidica

Question 4

Che cos’è un tampone?

Answer 4

Genericamente è la soluzione in cui è lisato il campione.

Question 5

Quali sono i tamponi più usati?

Answer 5

acido citrico o formico.

Question 6

Quali sono le caratteristiche di un tampone?

Answer 6

Di solito sono a pH fisiologico intorno a 7- 7.4. Sono stabili, di solito non hanno assorbanza nel campo del visibile (o se quantifico la proteina l’assorbanza del tampone mi fa sovrastimare). Non chela anioni o cationi specifici. I tamponi si usano sulla base anche del pKa costante acida di ogni proteina di interesse.

Question 7

Perché è importante che un tampone agisca sulla pKa?

Answer 7

Ogni proteina ha una sua carica specifica in funzione del amminoacidi. L’interazione tra loro determina la pka dell’intera proteina. In funzione della pka posso calcolare il ph che serve per far sì che la proteina precipiti o resti in soluzione. Quando il ph è uguale al punto isoelettrico della proteina di interesse, la proteina ha carcica netta nulla e può o precipitare o restare in soluzione: cosa che sfrutto per esempio per separarla da una miscela complessa o si fa precipitare il contaminante.

Question 8

Che cos’è il salting in e il salting out?

Answer 8

Modulando la concentrazione salina del buffer si può fare la precipitazione delle proteine facendo salting out (rendendo più o meno disponibile il solvente intorno alla proteina di interesse, facendola precipitare) o il salting in (più sale maschera la carica degli ioni che mascherano la carica della proteina rendendola meno precipitante e quindi in soluzione). Dipende da cosa serve dopo.

Question 9

Quali sono alcuni inibitori delle proteasi?

Answer 9

pmsf, edta, leupeptina, pepstatina

Question 10

In cosa si distinguono le tecniche di estrazione?

Answer 10

meccaniche e non meccaniche

Question 11

Quali sono le tecniche di estrazione meccaniche?

Answer 11

omogenizzatore, sonicatore, bread mill, French press

Question 12

quali sono tecniche di estrazione non meccaniche?

Answer 12

enzimatiche (lisozoma, chitinasi), chimiche (toluene, acetato di etile) e, se serve disgregazione cellulare, anche shock osmotico, congelamento scongelamento etc

Question 13

come si purifica un tessuto disgregato?

Answer 13

tramite centrifuga

Question 14

che principio sfrutta la centrifuga?

Answer 14

di archimede

Question 15

Quali sono i parametri che influenzano una corsa in campo centrifugo?

Answer 15

dimensione molecole, densità fluido e forma molecole.

Question 16

Che cos’è la condizione isopicnica?

Answer 16

è la condizione in cui, applicato campo centrifugo, la particella va in basso finché non ci sono differenze tra forza che spinge verso l’alto (dovuta al principio di archimede) e forza verso il basso applicata dal campo centrifugo

Question 17

Come posso sfruttare la condizione isopicnica?

Answer 17

Avendo le particelle diversa forma, si può settare il campo e la viscosità del mezzo per far sì che le particelle abbiano diverse condizioni isopicniche: se conosco la mia molecola di interesse, so dove andrà a finire.

Question 18

da cosa dipende la forza centrifuga a cui è sottoposta la particella in centrifuga?

Answer 18

da massa, distanza dal rotore e velocità angolare (arco diviso raggio).

Question 19

Quali sono le particelle che sedimentano prima?

Answer 19

quelle lontane dal centro, perché avranno una velocità angolare maggiore

Question 20

Come puoi normalizzare una procedura, se usi una centrifuga a raggio diverso?

Answer 20

tramite normogrammi

Question 21

Cosa dice la legge di Stock?

Answer 21

Che la velocità di sedimentazione di una particella è in funzione alla costante della particella sferica, raggio della particella e sua densità, e densità del mezzo, viscosità del mezzo e campo gravitazionale G (che però tiene conto anche del raggio del rotore perché viene accelerato), così si ottiene un coefficiente di sedimentazione (espresso in Svedberg) specifico per ogni analita

Question 22

Perché è importante sapere il coefficiente di sedimentazione?

Answer 22

Perché se conosco il coefficiente di sedimentazione del target di interesse e la densità del mezzo, si calcoli la velocità di sedimentazione e quindi si può capire se si può separare dna da rna etc

Question 23

Il tempo è importante in una centrifugazione?

Answer 23

Il tempo influenza la sedimentazione: tempi più lunghi significano maggior compattazione di proteine nella soluzione complessa; tempi brevi non bastano a separare opportunamente gli analiti che hanno coefficienti di sedimentazioni molto simili.

Question 24

Come si distinguono le centrifughe in base alle RPM?

Answer 24

Bassa è 7.000 rpm, media 16.000, alta 26.000, ultra 150.000.

Question 25

Che tipi di rotore esistono?

Answer 25

ad angolo fisso o oscillante

Question 26

Che tipi di tecniche di centrifugazione esistono?

Answer 26

• differenziale
• zonale
• isopicnica
• isopicnica con gradiente

Question 27

In cosa consiste la centrifugazione differenziale?

Answer 27

è la classica: non applica nessuna modificiazione della soluzione ma si inserisce il tubo nel motore, applico forza centrifuga e man mano che il campo centrifugo aumenta le particelle si distribuiscono lungo il mezzo finché raggiungono la stessa densità del mezzo e quindi la condizione isopicnica: forza alto e basso sono equiparate e la particella si ferma. Non separa particelle simili tra loro

Question 28

In cosa consiste la centrifugazione zonale?

Answer 28

Si applica un gradiente nella provetta con un gel a densità e viscosità maggiore, così la particella corre lungo il gel con un attrito maggiore che separa meglio.
Particelle più grandi spingono via il gradiente e vanno più in fretta. Si può avere un gel a unico gradiente o gradiente discontinuo e via via crescente a scalini. Può essere fatto a scalini o ci sono soluzioni che creano gradiente continuo nella soluzione.

Question 29

Che sostanza si usa di solito per una centrifugazione zonale?

Answer 29

il Faicoll: una soluzioe viscosa di polisaccaride ramificato che si usa per separare globuli bianchi da sangue intero.
Il gel deve essere denso, viscoso, compatibile con i matrriali biologici e non deve penetrare la membrana biologica, né assorbire luce ultravioletta (se serve lo spettrofotometro).

Question 30

Che limiti ha la centrifugazione?

Answer 30

Non basta a separare proteine troppo simili tra loro: meglio usare la cromatografia

Question 31

In una cromatografia, che cos’è il coefficiente di partizione o parametro alfa?

Answer 31

è il rapporto tra soluto ad-sorbito (legato alla fase stazionaria) rispetto a a quello in soluzione, lavato via dalla fase mobile. Se non c’è interazione tra fase mobile e stazionaria, alfa =0. Se c’è massimo assorbimento alfa=1. Tra 0 e 1 ci sono diverse condizioni per separare due proteine simili ma non identiche tra loro.

Question 32

Che tipi di cromatografie esistono?

Answer 32

• per gel filtrazione (separa in base a dimensioni)
• a scambio ionico (separa in base a carica)
• di affinità (con immunoglobuline o legame his-tag: due proteine che interagiscono in modo specifico tra loro)

Question 33

Qual è lo svantaggio della cromatografia per gel filtrazione?

Answer 33

Serve una soluzione non viscosa, se no impacca i micropori delle biglie del gel, e si usano solo piccoli volumi

Question 34

come funziona la cromatografia a scambio ionico?

Answer 34

le biglie hanno carica es negativa se mi serve una proteina negativa: la positiva resta attaccata e la negativa esce. una soluzione salina non va bene

Question 35

Di cosa sono fatte le fasi stazionarie in una cromatografia?

Answer 35

resine di agarosio, celulosa o altri polimeri.
Se si usa agarosio le colonne si chiamano “cefalos”.
Se si usa destrano la colonna è “sepalex”

Question 36

Che cos’è un cromatogramma?

Answer 36

è il segnale dell’eluato rilelaborato dal detector in funzione del tempo o del volume di eluizione. Si ottiene un tracciato cromatografico: ogni picco è una separazione della colonna. Se conosci il picco della molecola trovi il picco di tuo interesse. Due picchi vicini: bassa risoluzione.