Fase preanalitica: estrazione, purificazione, arricchimento etc Flashcards
Come estrarre le proteine da un tessuto o campione?
La prima cosa è scegliere il buffer: nello stool test per esempio, le feci vanno sospese: serve il buffer ideale a seconda di cosa va cercato. Per proteine nel cervello o osso: bisogna disgregare il tessuto solido, quindi prendendo le cellule per poi studiarle etc. Per recuperare una proteina serve evitare di inserire agenti denaturanti (temperatura, ph di solito, fattori ossidanti es radicali ossigeno e fattori precipitanti es tannini). Si aggiunge poi un cocktail di inibizione delle proteasi.
Dopo aver estratto le proteine dal campione, come si procede?
Si fa una centrifugazione
Cosa contiene un cocktail per la lisi cellulare?
inibitori delle proteinasi, EDTA per bloccare i radicali, poi di solito si lavora in ghiaccio, detergenti per rompere la membrana cellulare lipidica
Che cos’è un tampone?
Genericamente è la soluzione in cui è lisato il campione.
Quali sono i tamponi più usati?
acido citrico o formico.
Quali sono le caratteristiche di un tampone?
Di solito sono a pH fisiologico intorno a 7- 7.4. Sono stabili, di solito non hanno assorbanza nel campo del visibile (o se quantifico la proteina l’assorbanza del tampone mi fa sovrastimare). Non chela anioni o cationi specifici. I tamponi si usano sulla base anche del pKa costante acida di ogni proteina di interesse.
Perché è importante che un tampone agisca sulla pKa?
Ogni proteina ha una sua carica specifica in funzione del amminoacidi. L’interazione tra loro determina la pka dell’intera proteina. In funzione della pka posso calcolare il ph che serve per far sì che la proteina precipiti o resti in soluzione. Quando il ph è uguale al punto isoelettrico della proteina di interesse, la proteina ha carcica netta nulla e può o precipitare o restare in soluzione: cosa che sfrutto per esempio per separarla da una miscela complessa o si fa precipitare il contaminante.
Che cos’è il salting in e il salting out?
Modulando la concentrazione salina del buffer si può fare la precipitazione delle proteine facendo salting out (rendendo più o meno disponibile il solvente intorno alla proteina di interesse, facendola precipitare) o il salting in (più sale maschera la carica degli ioni che mascherano la carica della proteina rendendola meno precipitante e quindi in soluzione). Dipende da cosa serve dopo.
Quali sono alcuni inibitori delle proteasi?
pmsf, edta, leupeptina, pepstatina
In cosa si distinguono le tecniche di estrazione?
meccaniche e non meccaniche
Quali sono le tecniche di estrazione meccaniche?
omogenizzatore, sonicatore, bread mill, French press
quali sono tecniche di estrazione non meccaniche?
enzimatiche (lisozoma, chitinasi), chimiche (toluene, acetato di etile) e, se serve disgregazione cellulare, anche shock osmotico, congelamento scongelamento etc
come si purifica un tessuto disgregato?
tramite centrifuga
che principio sfrutta la centrifuga?
di archimede
Quali sono i parametri che influenzano una corsa in campo centrifugo?
dimensione molecole, densità fluido e forma molecole.
Che cos’è la condizione isopicnica?
è la condizione in cui, applicato campo centrifugo, la particella va in basso finché non ci sono differenze tra forza che spinge verso l’alto (dovuta al principio di archimede) e forza verso il basso applicata dal campo centrifugo
Come posso sfruttare la condizione isopicnica?
Avendo le particelle diversa forma, si può settare il campo e la viscosità del mezzo per far sì che le particelle abbiano diverse condizioni isopicniche: se conosco la mia molecola di interesse, so dove andrà a finire.
da cosa dipende la forza centrifuga a cui è sottoposta la particella in centrifuga?
da massa, distanza dal rotore e velocità angolare (arco diviso raggio).
Quali sono le particelle che sedimentano prima?
quelle lontane dal centro, perché avranno una velocità angolare maggiore
Come puoi normalizzare una procedura, se usi una centrifuga a raggio diverso?
tramite normogrammi
Cosa dice la legge di Stock?
Che la velocità di sedimentazione di una particella è in funzione alla costante della particella sferica, raggio della particella e sua densità, e densità del mezzo, viscosità del mezzo e campo gravitazionale G (che però tiene conto anche del raggio del rotore perché viene accelerato), così si ottiene un coefficiente di sedimentazione (espresso in Svedberg) specifico per ogni analita
Perché è importante sapere il coefficiente di sedimentazione?
Perché se conosco il coefficiente di sedimentazione del target di interesse e la densità del mezzo, si calcoli la velocità di sedimentazione e quindi si può capire se si può separare dna da rna etc
Il tempo è importante in una centrifugazione?
Il tempo influenza la sedimentazione: tempi più lunghi significano maggior compattazione di proteine nella soluzione complessa; tempi brevi non bastano a separare opportunamente gli analiti che hanno coefficienti di sedimentazioni molto simili.
Come si distinguono le centrifughe in base alle RPM?
Bassa è 7.000 rpm, media 16.000, alta 26.000, ultra 150.000.
