Immunodosaggi per metodiche qualitative o semi-quantitative Flashcards
Cosa fa l’istochimica?
Usa una colorazione per visualizzare uno specifico antigene in una fetta di tessuto. In particolare Ematosina Eosina (basica) e rosso congo( acida) sono specifiche per la beta amiloide, sia in vivo che post mortem. Servono a una conferma diagnostica di alzheimer. Non sono tecniche “immuno” perché non usano l’immunocomplesso
Come posso essere sicura che ematosina eosina e congo red hanno funzionato?
Con l’uso di un microscopio a luce polarizzata: diventa verde, che è la prova che è avvenuta una deposizione intorno al vaso e presenza di placche.
Oggi per l’alzheimer e la caa si usano coloranti aspecifici?
No, si usano anticorpi: la colorazione è data dall’anticorpo 4G8, stesso clone per fare la curva di calibrazione.
Quali sono i limiti di una colorazione immunoistochimica?
si può usare un solo anticorpo o colorante alla volta. Una volta che si mette l’anticorpo, la tecnica è distruttiva e non si può inserire un secondo marcatore
Perché l’immunoistochimica è una tecnica qualitativa o semiquantitativa?
perché può solo dirti se l’analita ricercato è presente e se ce n’è tanto o poco
Se voglio contare le cellule, es le cellule infiammate in caso di caa-ri, come faccio?
uso l’immunofluorescenza
Come funziona l’immunofluorescenza?
Si lega un anticorpo marcato con un fluoroforo: non solo si sviluppano ioni H+ ma anche una luce, per cui diverse fluorescenze equivalgono a diversi anticorpi.
Se la proteina gialla è attaccata all’antigene blu, si sviluppa un colore verde: posso vedere più proteine per volta.
L’immunofluorescenza richiede una fase di preparazione del campione e non è immediata.
Una volta preparato il campione, si parte con la marcatura e l’antigene specifico.
Che differenza c’è tra immunofluorescenza diretta e indiretta?
Nell’immunofluorescenza indiretta l’anticorpo non è marcato, ma viene poi legato a un anticorpo secondario che è marcato. Si usa se non ci sono già anticorpi con fluorofori disponibili in commercio per l’analita ricercato. Nella diretta è l’anticorpo primario a essere legato direttamente.
Quali sono gli svantaggi di un’immunofluorescenza?
il limite è a 4 traccianti quindi posso usare al massimo 4 anticorpi per volta (si può raddoppiare fino a 8 se li si combina)
Come funzionano i fluorofori?
Ognuno ha una lunghezza di eccitazione diversa e dà luogo a lunghezze d’onda diverse, dando una colorazione verde/arancione/rossa. Le fluorescenze si guardano sotto un microscopio che eccita il fluorocromo.
Qual è la metodica semi quantitativa di immunofluorescenza?
la citofluorimetria
Cosa fa la citofluorimetria?
Permette tramite immuno-complesso di quantificare la presenza di una popolazione cellulare specifica. È una tecnica in fase liquida, a differenza dell’istochimica, perché agisce su un fluido biologico.
La citofluorimetria è una tecnica quantitativa?
Non è quantitativa in termini assoluti, ma dà un rapporto in percentuale, es tot% di granulociti etc.
Quali sono i limiti di una citofluorimetria?
Funziona con traccianti fluorescenti e quindi si possono adoperare al massimo 8 traccianti (se combinati), inoltre non ti dice “dove” si trova l’analita in questione.
Come si chiama lo strumento che effettua una citofluorimetria?
Citofluorimetro o FACS: fa comparire un istogramma con un tracciato che presenta i picchi di fluorimetria, a uno o più parametri. Un tubo micrometrico risucchia una cellula per volta e un laser eccita una fluorescenza (legato all’anticorpo) rilevato poi da un sistema di rilevazione.
Per cosa si usa per lo più un citofluorimetro?
Spesso serve a contare leucociti, granulociti e monociti.
anti-cd45 è un marcatore per linfociti, ma è presente anche anche sui monociti e un po’ sui granulociti.
C’è spesso bisogno di 2-5 marcatori. Non esistomo molecole espresse solo su una popolazione cellulare specifica.
Qual è un’evoluzione più moderna del FACS?
Il facs sorter: dopo aver portato la cellula in una cella di lettura, un getto di aria compressa la smista in base alla fluorescenza
Come ci si accerta di star contando cellule intere?
inserendo nanoparticelle delle dimensioni di microvescicole (espresse dalla cellula che si sta lisando)
Oltre alla citofluorimetria, quali altre tecniche valutano la presenza di cellule/anticorpi in fase liquida?
La turbidimetria e la nefelometria.
Come funziona la turbidimetria?
Usa quasi sempre un anticorpo, legato a una biglia o no. Misura la torbidità di una sostanza. È una proprietà ottica valutata sulla base dell’assorbanza. quanto più la soluzione è torbida, quanto più corrisponde a un aumento della dispersone dell’analita in soluzione. Il raggio è lineare e non deviato
Come funziona la nefelometria?
valuta la dispersione della luce incidente. Nella nefelometria i raggi di luce incidente deviano e quindi si valiuta la loro dispersione. Una sorgente (monocromatore) seleziona una lunghezza d’onda specifica. Il fascio di luce colpisce la cella dove è contenuta la soluzione. Se il fascio uscente è minore, è stato deviato dalla soluzione più o meno torbida (turbidimetria), se lo disperde in tutte le parti si misura a diverse angolazioni la luce deviata (nefelometria)
