Immunodosaggi per metodiche qualitative o semi-quantitative Flashcards
Cosa fa l’istochimica?
Usa una colorazione per visualizzare uno specifico antigene in una fetta di tessuto. In particolare Ematosina Eosina (basica) e rosso congo( acida) sono specifiche per la beta amiloide, sia in vivo che post mortem. Servono a una conferma diagnostica di alzheimer. Non sono tecniche “immuno” perché non usano l’immunocomplesso
Come posso essere sicura che ematosina eosina e congo red hanno funzionato?
Con l’uso di un microscopio a luce polarizzata: diventa verde, che è la prova che è avvenuta una deposizione intorno al vaso e presenza di placche.
Oggi per l’alzheimer e la caa si usano coloranti aspecifici?
No, si usano anticorpi: la colorazione è data dall’anticorpo 4G8, stesso clone per fare la curva di calibrazione.
Quali sono i limiti di una colorazione immunoistochimica?
si può usare un solo anticorpo o colorante alla volta. Una volta che si mette l’anticorpo, la tecnica è distruttiva e non si può inserire un secondo marcatore
Perché l’immunoistochimica è una tecnica qualitativa o semiquantitativa?
perché può solo dirti se l’analita ricercato è presente e se ce n’è tanto o poco
Se voglio contare le cellule, es le cellule infiammate in caso di caa-ri, come faccio?
uso l’immunofluorescenza
Come funziona l’immunofluorescenza?
Si lega un anticorpo marcato con un fluoroforo: non solo si sviluppano ioni H+ ma anche una luce, per cui diverse fluorescenze equivalgono a diversi anticorpi.
Se la proteina gialla è attaccata all’antigene blu, si sviluppa un colore verde: posso vedere più proteine per volta.
L’immunofluorescenza richiede una fase di preparazione del campione e non è immediata.
Una volta preparato il campione, si parte con la marcatura e l’antigene specifico.
Che differenza c’è tra immunofluorescenza diretta e indiretta?
Nell’immunofluorescenza indiretta l’anticorpo non è marcato, ma viene poi legato a un anticorpo secondario che è marcato. Si usa se non ci sono già anticorpi con fluorofori disponibili in commercio per l’analita ricercato. Nella diretta è l’anticorpo primario a essere legato direttamente.
Quali sono gli svantaggi di un’immunofluorescenza?
il limite è a 4 traccianti quindi posso usare al massimo 4 anticorpi per volta (si può raddoppiare fino a 8 se li si combina)
Come funzionano i fluorofori?
Ognuno ha una lunghezza di eccitazione diversa e dà luogo a lunghezze d’onda diverse, dando una colorazione verde/arancione/rossa. Le fluorescenze si guardano sotto un microscopio che eccita il fluorocromo.
Qual è la metodica semi quantitativa di immunofluorescenza?
la citofluorimetria
Cosa fa la citofluorimetria?
Permette tramite immuno-complesso di quantificare la presenza di una popolazione cellulare specifica. È una tecnica in fase liquida, a differenza dell’istochimica, perché agisce su un fluido biologico.
La citofluorimetria è una tecnica quantitativa?
Non è quantitativa in termini assoluti, ma dà un rapporto in percentuale, es tot% di granulociti etc.
Quali sono i limiti di una citofluorimetria?
Funziona con traccianti fluorescenti e quindi si possono adoperare al massimo 8 traccianti (se combinati), inoltre non ti dice “dove” si trova l’analita in questione.
Come si chiama lo strumento che effettua una citofluorimetria?
Citofluorimetro o FACS: fa comparire un istogramma con un tracciato che presenta i picchi di fluorimetria, a uno o più parametri. Un tubo micrometrico risucchia una cellula per volta e un laser eccita una fluorescenza (legato all’anticorpo) rilevato poi da un sistema di rilevazione.
