Gammaglobuline & ELISA

Question 1

qual è la struttura di un anticorpo?

Answer 1

due coppie di catene polipeptidiche, una leggera (20kD, 220AA) e una pesante (55kD, 430AA), legate tra loro da tre ponti di solfuro.

Question 2

Come si chiama la zona ipervariabile di un anticorpo?

Answer 2

paratropo

Question 3

Che tipo di legame è l’immunocomplesso?

Answer 3

non covalente perché reversibile: ponti di idrogeno, legami ionici, forze di van der waals. è monovalente, bivalente o polivalente, e lega una proteina con costante di associazione bassa

Question 4

Qual è la differenza tra anticorpi monoclonali e policlonali?

Answer 4

i monoclonali riconoscono tutti uno stesso segmento di proteina (antigene), mentre i policlonali riconoscono lo stesso antigene, ma in segmenti diversi.

Question 5

Come si producono anticorpi monoclonali?

Answer 5

Dopo aver inoculato una specie di un determinato antigene, si preleva il suo sangue e si isola ogni singola plasmacellula. La si fonde con una tumorale per immortalizzarla: ciascuna produrrà un determinato anticorpo monoclonale.

Question 6

Come si producono anticorpi policlonali?

Answer 6

Si inocula una specie, si preleva siero e si purificano le plasmacellule: le si immortala in vitro e le si mette in colutra.

Question 7

In base a cosa si distinguono gli immunodosaggi?

Answer 7

in base al tipo di supporto: solido (elisa, western blott, immunoistochimica) o liquido (neferometria, citofluorimetria). Oppure in base al metodo di rilevazione: immunochimica e immunofluorescenza.

Question 8

Che cos’è l’ELISA?

Answer 8

un immunodosaggio che, sfruttando l’immunocomplesso, utilizza anticorpi marcati con una fluorescenza la cui intensità di luce viene letta da un densitometro che rivela la quantità di agenti patogeni presenti nel campione biologico.

Question 9

Su cosa l’elisa non può dare indicazioni?

Answer 9

sulle proprietà biochimiche dell’analita, come peso molecolare, densità, disposizione spaziale etc.

Question 10

Che strumenti servono per un elisa?

Answer 10

• Densitometro (plate reader): scanner che rileva la luce
• piastra elisa in stirene o policarbonato
• anticorpi primari e secondari, buffer di lavaggio etc
• pipetta

Question 11

Che tipo di legame c’è tra anticorpo primario e piastra elisa?

Answer 11

è un legame covalente

Question 12

Che enzima è legato all’anticorpo secondario?

Answer 12

L’HRP, un enzima che in opportune condizioni di substrato genera colore

Question 13

Come mai si usano piastre in policarbonato?

Answer 13

Perché ha una forte capacità di legame per le proteine, le quali spontaneamente vi si attaccano. Alternativamente è possibile utilizzare le piastre in polistirene, attivate poi con proteine specifiche che riconoscono in maniera selettiva l’antigene.

Question 14

Come è fatta una piastra elisa?

Answer 14

da 96 pozzetti in 8x12, fisse o a strip. Sono piastre trasparenti e vi si può leggere la luminosità

Question 15

In quali casi si può usare una piastra elisa nera?

Answer 15

in caso in cui si lavori in fluorescenza: quando il raggio incidente stimola la produzione di fluorescenza, il pozzetto di fianco è schermato dal nero

Question 16

Qual è il primo step dell’elisa?

Answer 16

il coating: si adopera un buffer alcalino (pH 9.2-9.6) che favorisce l’adesione dell’anticorpo alla piastra: contiene tris dei sali e non ha detergenti. Si aggiungono proteine per orientare bene l’anticorpo. Si tiene a 4°C overnight in agitazione o a 25°C per 4-8 ore o a 2-4 ore a 37°C

Question 17

Qual è il secondo step dell’elisa?

Answer 17

Blocking: albumina da siero bovino o latte in polvere si legano alla plastica competendo con eventuali anticorpi meno specifici: così si è certi di saturare i legami aspecifici

Question 18

Qual è il terzo step dell’elisa?

Answer 18

Washing: l’albumina potrebbe competere negativamente con l’antigene e va lavata via con soluzioni non denaturanti con dentro Tris, Hepes o Fosfati (PBS) e detergenti molto blandi.

Question 19

Qual è il quarto step dell’elisa?

Answer 19

Binding: si inserisce il campione e la curva di calibrazione. Se l’antigene è presente, si legherà all’anticorpo primario dopo incubazione. Si lava il fluido in eccesso e si aggiunge l’anticorpo secondario, complessato a una sostanza che effettua un viraggio cromogeno

Question 20

A che enzima è coniugato l’anticorpo secondario?

Answer 20

Alla perossidasi del rafano (HRP), che in presenza di acqua ossigenata catalizza una reazione che con il TMB fa cambiare colore. Si può usare anche fosfatasi alcalina, ma con un diverso substrato (pNPP)

Question 21

In che modo avviene l’ultimo step dell’elisa, la fase di detection?

Answer 21

Tramite uno spettrofotometro che rileva l’assorbanza dei diversi pozzetti: l’intensità di colore sarà proporzionale alla curva di calibrazione

Question 22

Perché è importante lo stop nell’elisa?

Answer 22

Perché la reazione catalizzata dall’HRP non è controllata: va bloccata con un acido forte (solforico) che denatura tutte le proteine (tecnica distruttiva).

Question 23

Quanto dev’essere accurato un elisa?

Answer 23

non meno del 20%

Question 24

Come si costruisce la curva di calibrazione in un elisa?

Answer 24

usando lo standard iniziale in cui si fanno campionamenti standard. si parte dalla prima a concentrazione più alta. i primi due pozzetti si lasciano bianchi

Question 25

Ci sono due possibili effetti con l’elisa. Quali?

Answer 25

• Effetto prozona: troppo anticorpo o troppo antigene sballano la colorazione, dando effetto mucino
• Effetto matrice: qualcosa nel campione, come troppi lipidi, dà interferenza