Autoanticorpi anti Beta Amiloide per diagnosi di Caa-ri

Question 1

Che cos’è la caa-ri?

Answer 1

La forma infiammatoria di Caa: angiopatia amiloide cerebrale

Question 2

Che cos’è la angiopatia amiloide cerebrale?

Answer 2

patologia caratterizzata da depositi di beta-amiloide 40 nei vasi sanguigni di piccolo e medio calibro del cervello. Il 100% dei malati di alzheimer ha anche Caa

Question 3

Sarebbe ideale dosare i marcatori di alzheimer nel siero. Che tecnologia è stata inventata per questo?

Answer 3

SIMOA (singule molecule array): singola molecola perché si usano biglie magnetiche coniugate a un anticorpo specifico che lega l’antigene. Si aggiunge poi l’anticorpo secondario che genera un colore, poi rilevato.
Nel Simoa ci sono nanopori: le biglie in sospensione vengono poi fatte cadere in un disco pieno di nanopori di dimensioni di una singola nanobiglia– la biglia cade nel nanoporo, (2.7 micron) e ogni nanoporo è come un pozzetto e lo scanner rileva la luminescenza all’interno del singolo poro e posso dire se c’è o no una singola biglia (molecola) attivata. I livelli di sensibilità quindi sono molto più alti. Si chiama “digital elisa”

Question 4

Quale altra metodica simile al simoa sta emergendo?

Answer 4

una tecnica coreana: biglia magnetica, che lega un antigene di interesse ma invece di usare un secondario, ma le biglie sono messe in un campo magnetico che le fa ruotare: se hanno legato l’antigene ruotano più lentamente perché più grosse: lo strumento determina la differenza di velocità e il numero di biglie legate, e dà un segnale di concentrazione. È legato quindi allo spin.
Queste metodiche permettono di associare diverse biglie con diversi anticorpi e in un singolo campione si possono avere risultati di più marcatori.

Question 5

Quali sono le manifestazioni cliniche specifiche della Caa-ri?

Answer 5

decadimento cognitivo rapido e progressivo, disturbi dell’umore, emicranie, sedi focali (es perdi uso di braccio)

Question 6

Quali sono i sintomi radiologici della Caa riscontrabili nella risonanza magnetica nucleare (MRI)?

Answer 6

• iperintensità (segni bianchi nel cervello), perché c’è richiamo di fluido nel cervello che causa aree bianche, è indice di edema vasogenico e presunta infiammazione.
• Black spots dovuti a microemorraggie nello spazio epidurale: deposito di gruppo eme (ferro) a livello del cervello– si è rotto vaso, sangue deposita e resta per la vita.

Question 7

Chi è più incline a sviluppare eventi avversi come swelling e bleeding in presenza di caa-ri?

Answer 7

I portatori dell’aplotipo apoepsilon 4 (ma non è ancora nei criteri diagnostici)

Question 8

Come si chiamano gli eventi come black spots e iperintensità visibili all’mri?

Answer 8

aria (Edema Related Image abnormalities Hemorrage)

Question 9

perché la caa-ri è difficile da diagnosticare?

Answer 9

perché l’iperintensità dovuta al richiamo di fluidi è riscontrabile anche in altri casi, come neoplasie cerebrali o pres (posterior reversible encefalopathy syndrome). Ha manifestazioni cliniche acute o sub-acute che mimano le malattie cardiovascolari

Question 10

Come si dosano gli auto anticorpi tipici della caa-ri, contro la beta amiloide?

Answer 10

Con biglie magnetiche funzionalizzate con una proteina (in questo caso proteina G di origine microtica, o A) che lega le immunoglobuline: si mette le biglie nel liquor, tolgo poi il liquido e ho le immunoglobuline concentrate: 50 microlitri entrano in un pozzo elisa e da un ml si arriva a concentrare 10 volte le immunoglobuline e si dosano. Poi si procede con un elisa indiretto: si lega alla piasra la proteina beta amieloide: se ci sono anticorpi specifici per la amiloide si legano al pozzetto, secondario etc etc.

Question 11

cosa si scopre degli auto anticorpi nel liquor in pazienti con sospetta caa-ri?

Answer 11

che gli autoanticorpi sono fino a 3 volte più concentrati che in pazienti sani. in fase di remissione, le immunoglobuline tornavano normali

Question 12

che livelli di beta amiloide 40 e 42 si riscontrano nel liquor di pazienti con caa-ri, che presentano auto anticorpi alti?

Answer 12

alte beta amiloide 40 e 42: gli autoanticorpi effettivamente disgregano le placche e le fibrille, rilasciandole nel sangue– questo però causa rottura dei vasi. Quindi chi ha la caa-ri ha MENO beta amiloide depositata! (come visibile in pet in vivo con tracciante radioattivo)

Question 13

perché è importante lo studio della caa-ri?

Answer 13

perché è un caso in cui spontaneamente i pazienti sviluppano autoanticorpi che poi disgregano la beta amiloide: questo può essere usato come punto di partenza per studiare un farmaco che curi l’alzheimer

Question 14

come si chiama la biobanca in cui hanno effettuato questi studi?

Answer 14

aicab

Question 15

Che cura si è provata per la caa-ri, e in particolare nei soggetti che riscontrano ARIA?

Answer 15

5 boli di cortisone per 5 giorni di fila endovena, e poi dosi via via diminuenti: l’80% dei soggetti risolveva gli eventi avversi in 5 mesi– la microglia era spenta e il soggetto aveva risolto clinicamente e radiologicamente il problema

Question 16

Che cos’è l’aria paradox?

Answer 16

Se si ha poca angiopatia, con l’anticorpo terapeutico si rimuove poca beta amiloide e la si elimina tramite vaso.
In un soggetto invece con molte placche, c’è maggior rischio di sviluppare aria per effetto paradosso del farmaco: toglie le placche in maniera massiccia e rilascia troppa betamiloide che fa rompere il vaso.

Question 17

Come è meglio dunque scegliere i soggetti per i clinical trial?

Answer 17

meglio quelli con poca Caa, e, se ci sono soggetti con alti anticorpi spontanei, dando il farmaco, si somma l’anticorpo spontaneo al farmaco, e si raggiunge più velocemente il cutoff. Allora si deve avere una dose personalizzata!

Question 18

in cosa si distinguono le aria?

Answer 18

in aria-e (edema, white areas) e aria-h (emorraggia, black spot)

Question 19

Come funziona di preciso l’anticorpo monoclonale dato come farmaco nei clinical trial per l’alzheimer?

Answer 19

Non si sa bene, ma fose attiva la microglia che fagocita la placca di beta amiloide. Oppure forse (sink effect) alcuni anticrorpi non attraversano barriera ematoencefalica, ma rimuovono ciò che c’è in periferia e per osmosi tolgono quello che c’è nel cervello (meno probabile)

Question 20

Cosa c’è nel richiamo infiammatorio della Caa-ri?

Answer 20

Macrofaci e microglia attivata a livello di vasi affetti, più presenza di cellule T e B.

Question 21

Come si fa ad avere certezza di caa-ri?

Answer 21

tramite biopsia cerebrale!!! ma è problematica

Question 22

Come si comportano gli autoanticorpi durante la fase acuta di Caa-ri?

Answer 22

Durante la fase acura di Caa-ri c’è aumento di 3 volte di anticorpi che ritornano poi a valori normali in seguito alla guarigione dovuta a corticosteroidi ad alto dosaggio 5 giorni consecutivi endovena e un lento e graduale riduzione di steroidi per via orale per i mesi o settimane dopo. Inoltre ricorda: anticorpi alti = beta amiloide alta!

Question 23

Perché servono metodiche ultra sensibili per il dosaggio degli auto anticorpi anti beta amiloide?

Answer 23

Perché per poter dire tramite elisa inverso (coating fatto con la beta amiloide) che gli anticorpi sono specifici per beta amiloide 40 o 42 devo essere certo che gli anticorpi che si legano non abbiano una affinità anche per 40 i 42.
Non posso escludere che una parte di anticorpi contati sia dovuta a anticorpi che legano meno specificamente la 40 o 42 (perché si distinguono solo per due aa).
Quanti anticorpi sono specifici per il monomero o fibrilla?
Se è specifico contro la fibrilla, va solo verso la placca; l’oligomero è un fenomeno autoimmunitario che avviene dopo la disgregazione della placca (se disgrego la placca libero proteina circolante che spiega questa associazione, quindi aria si sviluppa dopo perché il sistema immunitario produce anticorpi dopo).

Question 24

Come si fa a validare la metodica?

Answer 24

Serve il golden standard: una popolazione che al 100% per certo ha la malattia: dosi gli anticorpi e definisci un cutoff per chi non ha la malattia.
Il gold standard per la Caa-Ri è non solo la risonanza ma anche una amiloid pet per vedere la deposizione di beta amiloide, specie se non posso fare la biopsia. È possibile ora prendere una corte di 100 pazienti con alzhimer che aveva fatto una amiloid pet e una risonanza–alla loro morte hanno paragonato cosa vedeva il patologo rispetto alla amiliod pet e MRI. La amiloid pet vede solo le placche ma NON la Caa!

Question 25

Come si potrebbe avere più certezza di Caa-ri?

Answer 25

Associando la pet, il dosaggio della beta amiloide nel liquor, il dosaggio degli auto-anticorpi e la risonanza magnetico nucleare– così si potrebbe avere un algoritmo che dà una affidabilità maggiore

Question 26

Come funziona la proteina G nei batteri?

Answer 26

è usata dai microbi per evadere il sistema immunitario dell’organismo ospite durante infezione: lega le immunoglobuline e le “maschera”, evitando che si inneschi il meccanismo di riconoscimento

Question 27

come si adopera la proteina G legata alle biglie magnetiche?

Answer 27

inserite le biglie (con proteina G) in un campione, tutte le immunoglobuline in esso presenti si legheranno alla proteina e quindi alle biglie magnetiche– tramite uso di un magnete si può scartare il liquido extra e concentrarle

Question 28

Per dosare gli auto anticorpi, cosa succede, dopo l’uso delle biglie magnetiche (dynabeads)?

Answer 28

Si fa un elisa indiretto: alla piastra si lega la beta amiloide; si aggiungono le immunoglobuline del campione (concentrate tramite biglie): quelle apposta per la beta amiloide si legheranno all’antigene. Si aggiunge un secondario coniugato con la perossidasi del rafano, e si incuba overnight a 4°C. Gli autoanticorpi saranno detectati e tramite curva di calibrazione e si estrapola una curva standard

Question 29

A cosa serve dosare gli auto anticorpi?

Answer 29

per capire se un paziente con ARIA sta migliorando anche a livello biologico, non solo a livello radiologico/focale. Infatti si distingue un sottogruppo totalmente guarito e uno con auto-anticorpi ancora alti

Question 30

Quale altro marcatore, insieme agli auto anticorpi, si può utilizzare in caso di ARIA?

Answer 30

il TFPI: proteina del gruppo inibitore della coagulazione (spegne la coagulazione). È direttamente collegato con il danno endoteliale. Questo, più beta amiloide, più autoanticorpi, e bingo: eviti la biopsia

Question 31

Nell’elisa ultra sensibile si è usata (?) una beta amiloide commerciale di topo, ma gli anticorpi umani “primari” nel liquor ovviamente erano di umani. Il secondario luminoso quindi doveva essere per umani. Quali hanno considerato?

Answer 31

Gli anticorpi sono clone 6-10 il 4G8 o il G2-11.

il 4G8: è una IgG 2P che si lega al frammento aa 17-24 (zona centrale beta amiloide)