Técnicas en biología molecular Flashcards
por qué se purifica el DNA?
- detectar y cuantificar
- clonar genes y crear DNA recombinante
- secuenciación
por qué se se purifica RNA?
para el análisis de genes que se transcriben
Cómo se extraen los plasmidios
por lisis alcalina
EDTA
agente quelante que secuestra Mg+2
SDS
detergente que rompe membranas y denatura proteínas
para qué se utiliza el NaOH?
generar un gradiente de iones
fenol
agente corrosivo que denatura proteínas
KAc
aumenta la salinidad y precipita proteínas
para qué se utliza alcohol?
para precipitar al DNA
cómo se extrae el RNA?
método de chomczinsky y Sacchi (extracción ácida)
rompe la célula manteniendo la integridad del RNA
de qué maneras se puede secuenciar el DNA?
método químico o enzimático
En qué consiste la secuenciación por el método químico?
Se separa la muestra de DNA y se les elimina las bases por separado, y luego se les corta los enlaces fosfodiéster a ambos lados, dejando al fragmento marcado en el fosfato al extremo, hasta producir ~1 corte por hebra, representando las posiciones de cada base
En qué consiste la secuenciación por el método enzimático?
Se agregan diferentes dNTPs para marcar fragmentos de DNA en los extremos, uno para cada base.
PCR
reacción de polimerasa en cadena, es la amplificación enzimática de una muestra de DNA a traves de la manipulación de la t°
En qué consiste un PCR?
El DNA se denatura a altas t°, se hibrida con los partidores específicos y se sintetiza la hebra complementaria
Qué se requiere para realizar un PCR?
una molécula molde, primers, dNTPs y una DNA polimerasa termoestable
PCR en gradiante
Se optimiza la reacción para establecer una mejor t° de hibridación
PCR Hot-start
Se inactiva a la polimerasa a bajas t°, químicamente o con anticuerpos
touchdown PCR
Se parte con alta t° de hibridación de partidores, y se va bajando cada ciclo hasta alcanzar la t° óptima
RT - PCR
Se parte con mRNA y se utiliza una transcriptasa reversa para fabricar una hebra complementaria de DNA que luego se utiliza
PRC anidado
Se utilizan 2 parejas de primers, unos externos y otros internos, es el PCR de un PCR.
PCR con adición de adaptadores
se añaden adaptadores a los extremos de una muestra de secuencia desconocida
PCR inverso
Solo se conoce una secuencia específica de la muestra, que se corta y se pega de manera que las partes conocidas queden en los extremos
PCR en tiempo real
se monitorea con fluorescencia cada ciclo de amplificación en un termociclador que detecta fluorescencia
