Technologies de l'ADN Flashcards
Qu’est-ce qu’une nucléase?
Enzyme qui clive les liens phosphodiesters entre 2 nucléotides d’un ADN double brin
Qu’est-ce qu’une exonucléase?
Exonucléase qui clive à partir d’une extrémité
V ou F: Les exonucléases ne clivent que dans le sens 5’->3’
FAUX
Qu’est-ce que coupe l’endonucléase?
Le milieu de la chaine d’acide nucléique, produisant des fragments
Que sont les endonucléases de restriction?
Endonucléase qui clive en un endroit caractérisé par une séquence de nucléotides spécifique, dite de restriction
Quelles est l’utilité naturelle des enzymes de restriction?
Couper l’ADN étranger (système de défense des bactéries)
Donner des exemples d’enzymes de restriction
- ECOR
- HindIII
- HaeIII
- BamH1
Quel type de séquences reconnaissent les enzymes de restriction?
Séquences palindromiques
Quels types de bouts peuvent laisser les enzymes de restriction?
- bouts francs
- bouts collants
Quel technique permet de faire une analyse de restriction?
électrophorèse sur gel
Comment se fait la séparation sur gel d’agarose?
ADN (-) migre vers la cathode (+)
Quel agent permet la détection sur le gel?
Bromure d’éthydium, fluorescent
Que fait le bromure d’éthidium?
Molécule fluorescente qui s’intercale à l’intérieur de la double hélice
Comment obtient-on un ADN recombinant?
Recombiner les fragments d’ADN par ligase
V ou F: l’efficacité de ligation des bouts francs est plus faible que celle des bouts collants
VRAI (facteur 100)
Pourquoi la ligation est plus efficace pour les bouts collants?
interagissent entre eux, contrairement aux bouts francs qui doivent entrer en collision
Comment peut-on joindre un bout franc avec un bout collant?
- dNTPS pour terminer le bout collant
2. Ajout bout franc + ligase + ATP
Comment peut-on perpétrer et produire l’ADN recombiant?
Cloning: Insérer l’ADN dans un vecteur qui peut se répliquer de façon autonome
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de façon autonome
Que doit minimalement contenir un vecteur?
- ORI (origine de réplication)
- gène de sélection
- site de multiclonage
Quelles sont les étapes d’amplification du plasmide
- insérer l’ADN dans le vecteur
- transformation (insérer dans des bactéries)
- amplification
Quelles sont les utilités de l’ADN amplifié? (2)
- préparer une grande quantité de l’insert afin de le séquencer
- produire des protéines recombinantes (GH, insuline)
Qu’est-ce que la transformation?
Introduction d’un plasmide dans une souche de bactérie ou de levure
Quelle est au mieux l’efficacité de transformation?
1/2000
Comment identifier les cellules qui ont reçu le plasmide?
Sélection avec un antibiotique (marqueur de sélection)
Dans quelle section du plasmide est inséré le gène à traduire?
après le promoteur
Quelle protéine permet de reconnaitre en tant réel et in vivo les cellules transformées?
GFP
Que permet d’étudier GFP? (3)
- niveau de transcription
- niveau de traduction
- localisation cellulaire de protéines
- co-localisation cellulaire
L’ADN polymérase a toujours besoin de quoi?
d’une MATRICE simple brin
Comment se fait l’ouverture du double brin in vivo vs in vitro?
- in vivo: hélicase
- in vitro: dénaturation thermique
Quelle est la forme de la courbe de dénaturation (% selon température) ?
sigmoïde
V ou F: un double brin GC se dénature à plus basse température que AT?
FAUX car trois liens (inverse)
Que se passe-t-il lorsqu’on revient aux conditions normales avec l’ADN dénaturé?
hybridation, redevient double brin (renaturation)
Comment se fait la polymérisation de l’ADN in vitro?
brin matrice + nucléotides + polymérase
Comment est synthétisée l’amorce de brin matrice à compléter?
Par une machine
Que permet la méthode Senger?
Détecter une mutation, par exemple
Comment se différencie le ddNTP du dNTP?
ddNTP n’a pas de OH en 3’ et donc termine la chaîne
Quelles sont les étapes (4) de la méthode de terminaison de chaine?
1) Séparation des brins
2) ajout des amorces, des dNTPs, des ddNTPs marqués pour détection et de la DNA polymérase
3) séparation sur gel et détection des brins synthétisés
4) lecture sur gel
Comment est l’amorce dans la méthode de terminaison de chaine?
- 15 à 30 nucléotides
- oligonucléotide complémentaire au brin d’ADN matrice
Que veut dire ddNTP?
didéoxynucléotides
Que veut dire dNTP?
déoxynucléotide
Quelles sont les 3 principales étapes de la PCR?
1) séparation des brins (95c)
2) hybridation des amorces (55c)
3) synthèse par ADN polymérase TaqI (72c)
Quelle polymérase utilise-t-on en pcr?
Taq ADN polymérase, pas dénaturée par la chaleur
Comment sont faites les amplifications?
20-30 cycles de 5min chacun
Que sont les STR?
Séquences répétées de 5à200 fois dans un même locus
Quel est l’utilité des STR et VNTR en technologie?
DNA Fingerprinting par électrophorèse
Qu’est-ce qu’un VNTR?
Séquence répétée de 10-1500fois dans un même locus
Qu’est- ce que le polymorphisme des STR/VNTR?
La variabilité du nombre de séquences répétées
Quelle est l’utilité du polymorphisme?
Plus facile de faire un profil génétique, distinguer l’ADN des autres
Qu’est-ce que le SNP?
Single nucleotide polymorphism: polymorphisme d’un seul nucléotide
Quel pourcentage des variations génétique représentent les SNP?
90%
Quel pourcentage de l’ADN entre deux personnes est identique?
99.9%
V ou F: les variations d’ADN, même si elles ne présente que 0.1% entre les individus, peuvent fortement affecter le risque de maladie
VRAI
Caractéristiques des SNP en chiffres (3)
- 1/300 nucléotides
- 10 million/génome
Que permettront les SNP dans le futur?
Comprendre et traiter les maladies humaines
Quelle est la différence entre un SNP et une mutation?
- SNP est une variation de base d’ADN retrouvée dans >1% de la population
- Mutation est une variation de base d’ADN retrouvée dans <1% de la population
Que peuvent déterminer les SNP sur le cancer?
probabilité de l’avoir ou non
Quels traits peuvent être déterminés par les SNP (5)?
- couleur yeux et cheveux
- performance musculaire
- comportement social
- susceptibilité à des maladies
- réponse aux médicaments
Quels sont les types de SNP?
- causatifs
- 1des régions codantes
- 2des régions non codantes
- liés
Comment se caractérisent les SNP causatifs?
Causent un trait génétique, une maladie, une susceptibilité
Comment se caractérisent les SNP liés?
Sont à proximité d’un gène causant un trait génétique, ne causent pas de traits mais sont des marqueurs
Comment se caractérisent les SNP des régions codantes?
Peuvent affecter la séquence et la fonction des protéines
Comment se caractérisent les SNP des régions non-codantes?
Peuvent affecter l’épissage, la régulation du gène
Comment nomme-t-on des SNP proches les uns des autres?
haplotype
Comment se définit un haplotype?
Ensemble de variations de l’ADN pour de polymorphismes, qui ont tendance à être hérités ensemble
V ou F: On a besoin d’identifier un grand nombre de SNP pour identifer l’haplotype
FAUX, un haplotype peut contenir un grand nombre de SNP mais on a besoin d’en identifier que quelque uns.
Qu’est-ce que le projet HapMap?
Carte des blocs haplotypes et les SNP spécifique qui identifient les haplotypes (DNP-Tag)
Quel est le but du projet HapMap à court terme?
Réduire le nombre de SNPs requis pour examiner l’ensemble du génome pour l’association avec un phénotype (10 millions à 500k étiquettes)
Quels sont les buts du projet HapMap à long terme (3)?
- prédire la susceptibilité à des maladies
- tests génétiques pour prédisposition à une maladie
- offrir un traitement personnalisé
Que réglerait la médecine personnalisée quant aux médicaments?
Réduire le nombre de morts ou d’effets graves à cause des médicaments
En quoi consiste la médecine personnalisée?
Utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement pour qu’il soit le plus efficace dans le contexte du profile génétique et environnemental du patient
Que pourrait permettre la médecine personnalisée quant aux tumeurs?
Typer les tumeurs afin d’offrir le meilleur traitement possible
