T4 - Aislamiento, purificación y caracterización Flashcards
¿Qué factores pueden desnaturalizar la proteína durante la purificación?
- pH
- Tª
- Proteasas
- Oxidación (afecta a los puentes S-S)
- Contaminación
¿En qué consiste el proceso de purificación?
La purificación o fraccionamiento consiste en la obtención de diferentes fracciones a partir de una mezcla inicial de proteínas (Extracto crudo) en base a diferentes propiedades físico-químicas.
- Elección del material biológico.
- Extracción y solubilización - obtención del extracto crudo
- Purificación
PRECIPITADO POR SALADO
Al aumentar la concentración de iones en disolución se favorece la competencia por las moléculas de agua disponibles entre la proteína y los iones. La solvatación de los iones disminuye la solvatación de la proteína que tiende a liberar las moléculas de agua que rodea los parches hidrofóbicos. Cuando estos quedan expuestos se facilita la agregación y la precipitación de las proteínas.
A mayor hidrofobicidad de la proteína, menor concentración de sal se requiere para precipitar una proteína y viceversa.
Se suele emplear ULFATO DE AMONIO por su elevada solubilidad y bajo coste.
PRECIPITADO POR PUNTO ISOELÉCTRICO
El punto isoeléctrico es el valor de pH en el que la carga neta de la proteína es 0, por lo que la solubilidad de la proteína en ese punto es MÍNIMA.
En la práctica, esta técnica se combina con la precipitación por salado.
PRECIPITADO POR SOLVENTES ORGÁNICOS MISCIBLES CON EL AGUA
Estos disolventes (etanol, acetona) pueden establecer interacciones favorables con el agua como puentes de H, lo que reduce la disponibilidad de moléculas de agua para solvatar la proteína.
Los disolventes disminuyen la constante dieléctrica del medio, es decir, la capacidad del solvente para mantener iones en disolución, y por tanto, de mantener a las proteínas en disolución.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Distinguimos una fase móvil (solvente) que fluye a través de la columna arrastrando los componentes de la muestra, y una fase estacionaria que supone la matriz sólida y porosa que no se modifica en el proceso.
Las interacciones de las moléculas de la muestra con la fase estacionaria son lo que las retiene en la columna.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
(FILTRACIÓN EN GEL)
Separa las moléculas en función de su TAMAÑO. La fase estacionaria está constituida por gránulos de un material poroso hidratado - DEXTRANO o AGAROSA.
La partículas de mayor tamaño y peso molecular eluyen primero.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Separa las moléculas en función de su CARGA ELÉCTRICA. En la fase estacioanria se emplean grupos cargados como el CM (carboximetilo) o el DEAE (dietilaminoetilo) unidos covalentemente a la columna.
La proteína posee carga neta en función del pH del emdio y su PI, lo que le permite interaccionar con uno u otro tipo de resina.
1º eluyen las proteínas que no interaccionan (no tienen carga o la carga es del mismo signo)
2º eluyen las proteínas que interaccionan debido a que tienen carga opuesta a la columna. (Las menos cargadas eluyen antes)
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Separa las proteínas por su capacidad de unión específica a otras moléculas. La fase estacionaria contiene el ligando específico para la proteína de interés que queda retenida al añadir la muestra a la columna. Las proteínas no deseadas se lavan a través de la columna. Por último, se eluye la proteína de interés mediante una solución concentrada de ligando libre.
EJ. CONCANAVALINA Se une no covalentemente a la manosa en la columna y se libera de esta al añadir una disolución concentrada de manosa.
Ej. Cromatografía de inmunoafinidad.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA DEFINICIÓN (HPLC)
La separación puede basarse en la adsorción, el intercambio iónico, la exclusión molecular, en una fase de reserva, pero utilizando columnas de alta definición.
VENTAJAS:
- Mejora la resolución, útil para proteínas que se resisten en otras técnicas.
- Velocidad, pocas horas.
- Mayor sensibilidad, se emplean cantidades inferiores de material
- Automatización.
DESVENTAJAS:
- Elevado coste.
- No se puede usar en purificaciones a pequeña escala.
DIALISIS
ULTRAFILTRACIÓN: Se emplea una membrana de acetato de celulosa, nitrocelulosa o colodión y se obliga a pasar a una disolución de macromoléculas a través de ella mediante presión para separar las moléculas de tamaños diferentes.
ULTRACONCENTRACIÓN: Se para moléculas que presentan características distintas (TAMAÑO, FORMA, DENSIDAD…) mediante un conjunto de métodos que valoran la velocidad y equilibrio de sedimentación.
ELECTROFORESIS
Separación de moléculas con carga neta bajo la influencia de un campo eléctrico, Las proteínas se mueven a una velocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a su masa. (relación carga/masa)
Permite separar macromoléculas como proteínas o DNA/RNA al tiempo que se puede visualizar una estimación rápida del número de proteínas de una mezcla.
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
El gel de poliacrilamida actúa como un tamiz que separa las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética.
El tamaño de los poros de la retícula del gel puede regularse variando la concentración de los compuestos polimerizantes. Al aumentar la concentración de este compuesto, disminuye el tamaño del poro.
SDS-PAGE
Consiste en la electroforesis PAGE en presencia de un detergente aniónico, el DODECIL SULFATO SÓDICO (SDS).
La mayor parte de las proteínas se unen a SDS en la misma proporción, lo que da al complejo SDS-proteína una carga negativa proporcional a la masa de la proteína. La carga intrínseca de la proteína puede considerarse despreciable, por lo que todas las proteínas adquieren la misma proporción carga-/masa.
El SDS desestructura las proteínas dándoles una apariencia similar y separando las subunidades no unidas covalentemente. También se suele añadir β-mercaeptoetano para reducir los puentes disulfuro.
Resulta muy útil para estimar rápidamente el nº de proteínas de una mezcla o el grado de pureza.
Después de la electroforesis las proteínas se visualizan añadiendo un colorante como el azul de Coomasie o mediante autorradiografía (proteína marcada radioactivamente)
Algunas glicoproteínas migran anómalamente, por lo que la relación empírica NO es universal.
INMUNOTRANSFERENCIA o TRANSFERENCIA WESTERN
Supone la inmovilización de las proteínas sobre una membrana sintética para detectarlas.
1) Las proteínas son separadas por electroforesis PAGE en condiciones desnaturallizantes.
2) Se transfieren las proteínas a una membrana mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel.
3) Las proteínas son reveladas mediante un anticuerpo específico.
