Structural methods Flashcards
Perché si usano la diffrazione a raggi X sulle proteine cristallizzate?
Quali sono i passi per determinare la struttura con la diffrazione a raggi X?
Perché i raggi X hanno lunghezza d’onda dell’ordine delle distanze interatomiche e i cristalli sono utili per raccogliere in maniera ordinata molte proteine, in modo da amplificare il segnale che altrimenti sarebbe troppo debole se proveniente da una singola molecola.
Procedimento:
1. Sintesi del gene
2. Purificazione della proteina
3. Cristallizzazione
4. Diffrazione a raggi X
5. Mapping della densità elettronica e determinazione della struttura
Come si scrive il fattore di struttura di un sistema di N particelle? E in particolare quello di un atomo con simmetria sferica? E per una molecola? E per un sistema cristallino contenente una molecola per ogni cella?
Qual è l’andamento dei fattori di scattering atomici?
Vedi slides 6-7-8-9 Structural methods
Considerando un reticolo 1D infinito come si scrive il fattore di forma totale?
Da cosa è determinato il massimo numero di picchi visibili?
Come il prodotto tra il fattore di forma molecolare ed una serie di delta di Dirac.
Dal rapporto a/λ, all’aumentare di tale rapporto il numero di picchi visibili aumenta.
Come influisce la lunghezza d’onda sulla risoluzione della diffrazione?
La lunghezza d’onda determina Smax che definisce il dominio di integrazione dell’anti-FT. In particolare al diminuire della lunghezza d’onda aumenta il numero di picchi che si riescono a vedere nella figura di diffrazione, pertanto aumenta la risoluzione.
Da cosa dipende la posizione dei picchi nella figura di diffrazione? E l’intensità dei picchi?
La posizione dei picchi dipende dal passo del reticolo e dall’orientazione del cristallo stesso, mentre l’intensità dipende dal modulo quadro del fattore di forma molecolare.
Qual è il problema che coinvolge la fase contenuta nel fattore di forma?
Quale sono alcune strategie per rimediare a tale problematica?
Ciò che misuriamo noi del fattore di forma è l’intensità dei picchi, ovvero il modulo quadro di esso. Pertanto tutta l’informazione contenuta nella fase (che è più di quella contenuta nelle intensità) va persa.
Alcuni modi per risolvere il problema sono quello di usare degli atomi pesanti (?), oppure trarre la fase da un modello simile a quello misurato, e l’intensità da quest’ultimo.
Qual è il procedimento iterativo indicato per risolvere al meglio la struttura della molecola.
Come si misura il fattore di qualità del fit?
- Si registra l’intensità dei picchi
- Si introduce l’informazione sulla fase (stimata)
- Si ottiene la densità elettronica (tramite anti-FT)
- Si fitta per ottenere un modello atomistico
- Si ricalcola la fase basandosi sul modello ottenuto e si riprende dal punto 3
Vedi slide 22 Structural methods
Quando la struttura viene ricostruita usando diffrazione con elettroni o neutroni invece che raggi X?
Nel caso in cui non è possibile formare cristalli di dimensioni sufficientemente grandi si utilizzano gli elettroni, essendo in grado di interagire fortemente con la materia.
I neutroni interagiscono bene con i nuclei e sono utili per completare la struttura di una molecola, precedentemente risolta parzialmemte dai raggi X, rilevando la presenza degli atomi di H.
In cosa consiste la crio-microscopia elettronica?
Un fascio di elettroni viene fatto passare su una lastra sottile dove è presente il campione, gli elettroni sono assorbiti dal campione e da quelli che passano attraverso la lamina si può ricostruire un’immagine 2D dal campione.
Per prevenire la denaturazione della proteina, a causa del danno dovuto dall’assorbimento degli elettroni, si lavora a temperature criogeniche. Tuttavia questo può causare il congelamento dell’acqua e quindi, a causa dell’espansione di essa, il danneggiamento della struttura. Per evitarlo si sfrutta il sottoraffreddamento, portando l’acqua in stato vetroso.
Qual è la principale differenza tra il risultato fornito dalla diffrazione a raggi X e la NMR?
Mentre la diffrazione a raggi X fornisce una struttura e al massimo alcune possibili differenti conformazioni dei singoli componenti, la NMR fornisce un set di possibili conformazioni complessive in base ai vincoli risultanti dalla procedura. Queste differenti strutture possono essere dovute a:
* Insufficienti vincoli per determinare con più precisione la struttura
* Intrinseca libertà conformazionale della proteina stessa
Sebbene presenti questo svantaggio rispetto la diffrazione, la NMR non richiede la cristallizzazione del campione, questo permette anche lo studio di propietà dinamiche in seguito alla variazione dei parametri della soluzione.
Su cosa si basa la NMR?
Quando un nucleo con un certo spin è inserito in un campo magnetico esterno, il suo livello energetico si splitta in due livelli in base al segno dello spin per effetto Zeeman. La frequenza relativa all’energia di splitting è detta frequenza di Larmor.
Cosa si intende per chemical shift e come varia in base agli atomi legati al quello di interesse?
Gli elettroni attorno all’atomo fanno da schermo al campo magnetico esterno, quindi il nucleo percepisce un campo magnetico inferiore e quindi anche la frequenza di Larmor sarà più bassa. Il chemical shift è la frequenza di Larmor misurata relativamente ad uno standard.
Se l’atomo di cui si misura la frequenza di Larmor è legato ad uno molto elettronegativo, allora questo tenderà a privare della nube elettronica l’atomo di interesse, diminuendo l’effetto di screening e aumentando pertanto la frequenza di Larmor.
Definizione di chemical shift alla slide 36 Structural methods
Perché spesso negli spettri NMR si osservano picchi multipli?
Qual è l’effetto dell’accoppiamento di dipolo magnetico invece?
Nel caso di nuclei in vicinanza tra loro il campo magnetico di questi può aggiungersi a quello esterno causando uno splitting in due transizioni con frequenza di Larmor diversa, questo accoppiamento è detto J-coupling.
L’accoppiamento tra i dipoli magnetici non contribuisce ad alcuno splitting a differenza del J-coupling, questo perché in soluzione la molecola è in grado di ruotare e la media dell’interazione tra i dipoli è nulla.
Come avviene la ricostruzione di uno spettro NMR 1D?
- Si prepara il campione sottoponendolo ad un campo magnetico esterno (orientato lungo z) in modo da indurre una magnetizzazione Mz in esso.
- Si irraggia il campione a con un campo EM a radiofrequenza per un certo periodo di tempo, applicando così un ulteriore campo magnetico B1 in modo da ruotare la magnetizzazione di 90° (nel piano xy).
- Si interrompe il campo B1 e la magnetizzazione si riorienta lungo z con un moto a spirale. Si raccoglie il segnale oscillante di Free Induction Decay (FID) e se ne esegue la FT in modo da recuperare i picchi alle frequenze di risonanza dei nuclei.
Quali informazioni ci può dare uno spettro NMR sulla struttura della proteina?
In base allo stato della struttura secondaria lo spettro assume un diverso aspetto.
Per uno stato folded lo spettro presenta numerosi picchi dovuti al fatto che lo stesso amminoacido ripetuto in diversi punti della catena interagisce in maniera diversa con quelli attorno a se e quindi contribuisce a diversi picchi. Negli stati di molten globule e denaturato questa moltitudine di picchi non si presenta poiché la struttura subisce variazioni in tempi più brevi di quelli della NMR, che quindi “mediando” nel tempo di esecuzione restituisce per ogni amminoacido uguale nella proteina la stessa interazione con l’ambiente circostante.
Nel caso dello stato folded inoltre si osservano picchi anche ad un chemical shift negativo, questo è dovuto alla vicinanza di un nucleo ad un anello aromatico, la cui corrente sull’anello genera un campo magnetico che si aggiunge a quello esterno e che causa lo spostamento del chemical shift verso valori negativi.
