Molecular spectroscopy Flashcards

1
Q

Approssimazione di Born Oppenheimer

Scrivi l’hamiltoniana molecolare e spiega in cosa consiste l’approssimazione di Born Oppenheimer, sottolineando perchè è possibile

A

Siccome la dinamica dei nuclei è molto più lenta di quella degli elettroni allora si suppone che la funzione d’onda totale sia separabile in due contributi separati: una degli elettroni e l’altra dei nuclei (quest’ultimi ad una posizione fissata).

Vedi pag 4 Molecular spectroscopy I

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2
Q

Esempio di approx BO

Considerando l’esempio di una molecola di H2+:
* Scrivi l’equazione di Schrödinger sotto approssimazione di BO
* Cosa si ottiene risolvendo la parte elettronica?
* Cosa si ottiene invece risolvendo anche la parte nucleare?
* Qual è la limitazione principale di questa approssimazione?

A
  • Footnote
  • Quello che si ottiene sono varie curve di potenziale molecolare ognuna delle quali in base alla sua simmetria può essere legante o antilegante, rappresentando quindi uno stato stabile o meno
  • Risolvendo anche la parte nucleare otteniamo una sotto-divisione del potenziale molecolare in sottolivelli nucleari.
  • Che essa riferendosi ad un unico stato elettronico non vale più quando due stati elettronici sono troppo vicini in energia.

Vedi pag 5 Molecular spectroscopy I

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3
Q

Relazioni mnemoniche

  • Come si passa da lunghezza d’onda in nm a energia in eV?
  • Quanto vale kBT a temperatura ambiente in eV?
  • A quale lunghezza d’onda indicativamente si trovano l’UV e l’IR?
A
  • E[eV] = 1240/λ[nm]
  • kBTamb = 1/40 [eV]
  • UV 400 nm, IR 700 nm
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4
Q

Regola d’oro di Fermi

Scrivi il rate di transizione tramite la regola d’oro di fermi, usa l’approssimazione di dipolo per un campo oscillante e tieni conto della distribuzione in energia.
Approssimando la funzione d’onda nucleare ad essere molto più stretta di quella elettronica, esplicita l’elemento di matrice di dipolo, qual è il significato dei suoi componenti?
Cosa ci dice il principio di Franck Condon?

A

Vedi pag 9-10 Molecular spectroscopy I

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5
Q

Lambert-Beer

Scrivi la legge di Lambert-Beer e l’espressione dell’assorbanza.
Quali sono le dimensioni del coefficiente di estinzione?

A

Vedi pag 11 Molecular spectroscopy I

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6
Q

Spettro di assorbimento

Guarda il plot del coeff di estinzione a pag 12 Molecular spectroscopy I, cosa rappresentano i picchi? Perchè ad alte lunghezze d’onda non presente alcun picco?

A

I picchi corrispondono all’assorbimento della radiazione e quindi ad una transizione della molecola ad uno stato eccitato.
Ad alte lunghezze d’onda, cioè a basse energie ci troviamo nel gap tra i due stati elettronici e quindi non sono presenti stati disponibili per effettuare una transizione.

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7
Q

Broadening

Perchè lo spettro del coefficiente di assorbimento non si presenta come una serie di picchi ma come una curva continua?
Quali parametri esterni possono influenzare questo effetto?

A

Questo è dovuto all’effetto di allargamento.
Nel caso di vapore l’allargamento è molto inomogeneo vista la poca interazione delle particelle, quindi oltre ai picchi vibrazionali anche i sotto-picchi rotazionali sono visibili, mentre per una soluzione apolare le molecole che circondano il cromoforo si legano debolemente ad essa e i picchi rotazionali spariscono, infine se la soluzione è acquosa (polare) il cromoforo interagisce più intensamente con le molecole e l’allargamento diventa omogeneo.
innalzando la temperatura umentiamo la mobilità e rendiamo l’allargamento più omogeneo (?).

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8
Q

Cosa succede se due stati elettronici hanno stessa forma ed il loro minimo non presenta alcun displacement?
Cosa se invece il minimo ha displacement?
In cosa consiste l’approssimazione di displacement lineare e quanto vale in tal caso l’elemento di FC? Cosa si può dire riguardo al variare del displacement?

A

La transizione 0-0 è quella con il fattore di Frank-Condon maggiore ed è quella con il picco più alto, nel limite in cui sono i due stati elettronici sono uguali essa è anche l’unica transizione a sopravvivere.
Quella favorita è la 0-2.
L’approx in questione consiste nel considerare la forma dei due stati elettronici identiche ma con un certo displacement, all’aumentare del displacement lo spettro si allarga perchè sono sempre più i fattori di FC non nulli.

Vedi 16-17 Molecular spectroscopy I

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9
Q

All’aggiungere di più di un elettrone l’eq di Schrodinger non è più risolvibile analiticamente, quale approssimazione diventa utile?

A

Si approssima l’orbitale molecolare come combinazione lineare di quelli atomici, gli orbitali molecolari possono combinarsi simmetricamente (legame) oppure antisimmetricamente (antilegame), il primo ha un’energia minore dei legami atomici che lo formano ed è quindi il più stabile (favorisce il formarsi del legame), al contrario il secondo ha un’energia superiore rispetto gli orbitali atomici.

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10
Q

Orbitali di frontiera

Cosa sono gli orbitali HOMO e LUMO? Perchè sono importanti nelle molecole organiche?

A

HOMO: Highest Occupied Molecular Orbital
LUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital
Nelle molecole organiche le transizioni nello spettro UV-visibile le transizioni hanno luogo negli orbitali di frontiera o nei loro vicini.

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11
Q

Transizioni elettroniche molecolari

Considerando l’esempio del gruppo carbonile quali sono le principali transizioni possibili tra orbitali molecolari?
Perché una presenta alto assorbimento mentre l’altra basso assorbimento? Perchè quella attenuata non è esattamente nulla?

Vedi immagine slide 5 Molecular Spetroscopy II

A

Sono quelle che prevedono l’eccitazione di un elettrone da un orbitale di frontiera ad un orbitale libero, cioè nel caso del gruppo carbonile:
* π–>π*
* n–>π*
Gli orbitali π, π* e n sono simmetrici rispetto il piano yz, quindi il momento di dipolo può essere orientato solo lungo x.
L’orbitale π e π* sono antisimmetrici (cambiano segno) sotto simmetria sul piano xy, mentre n e il momento di dipolo sono simmetrici su tale piano (non cambiano segno). Pertanto applicando tale operatore di simmetria l’elemento di matrice del momento di dipolo si annulla per la transizione n–>π* ma non per quella π–>π*, pertanto la prima avrà una probabilità di transizione nulla.
Tuttavia a causa dell’accoppiamento vibronico la transizione n–>π* avrà una probabilità di transizione non nulla (seppure piccola).

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12
Q

Transizioni orbitali molecolari in soluzione

Spiega come varia lo spettro di assorbimento per transizioni n–>π* e π–>π* in molecole in soluzioni polari o apolari.

A
  • n–>π*: Prendendo l’esempio di una molecola polare come l’acetone lo stato n differisce da quello π* perché in quest’ultimo uno degli elettroni liberi è più delocalizzato e quindi la molecola ha un momento di dipolo inferiore rispetto al GS. Pertanto quando inserito in una soluzione polare viene stabilizzato maggiormente lo stato n rispetto al π* e di conseguenza aumenta il gap energetico di transizione, ovvero si osserva uno shift nel blu dello spettro di assorbimento.
  • π–>π*: l’effetto di shift è di gran lunga attenuato rispetto al precedente caso. Lo stato π* ha una funzione d’onda più estesa e quindi una polarizzabilità più alta, che si traduce in una maggior interazione con un solvente polare e quindi una maggiore stabilizzazione rispetto allo stato π, pertanto il gap di transizione diminuisce leggermente in questo caso contrariamente a n-π*.
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13
Q

Dipolo di transizione approssimato

Mostra com’è possibile scrivere un’espressione approssimata per il momento di dipolo di transizione dal GS al I stato eccitato per transizioni π–>π*.
Cosa si può dire sulla dipendenza dalla distanza di legame?

A

Vedi pag 8-9 Molecular spectroscopy II
Sembrerebbe che all’aumentare della lunghezza di legame anche l’elemento di matrice aumenti, tuttavia l’approx di Hartree-Fock non è più valida e la descrizione HOMO-LUMO non funziona più.

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14
Q

Spettro legame peptidico

Qual è la forma dello spettro di assorbimento di una molecola contenente legami peptidici?
Qual è il caso specifico di una proteina?

A

Il contributo dovuto al legame peptidico è quello di due picchi uno a circa 222 nm corrispondente alla transizione n–>π* e uno a 193 nm corrispondente a πnb–>π*, il primo è relativamente vicino al picco della transizione più intensa (πnb–>π*, coinvolgente un orbitale πnb non legante –> con energia più alta rispetto al π legante), appare come spalla del picco a 222 nm.

Nelle proteine oltre allo spettro appena descritto si aggiunge il contributo dei gruppi aromatici che fanno una transizione π–>π* e dunque si hanno dei leggeri picchi anche nel vicino UV (260-300 nm).

Vedi immagine slide 10 e 13 Molecular spectroscopy II

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15
Q

Qual è la forma dello spettro di assorbimento di un acido nucleico?

A

La base azotata svogle il ruolo di cromoforo ed ha uno spettro di assorbimento nell’UV (240-275 nm). La maggior parte delle transizioni è π–>π*, tuttavia ci sono anche dei doppietti solitari a causa della presenza di N ed O che conribuiscono a transizioni n–>π*.

Vedi pag 17 Molecular spectroscopy II

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16
Q

Iper/Ipocromismo

Perché avviene e cosa si intende per iper/ipocromismo negli acidi nucleici?

A

Si tratta dell’aumento/diminuzione dell’assorbanza al variare della conformazione strutturale dell’acido nucleico, in particolare se il coil è denaturato l’assorbanza è maggiore di quando l’elica è ancora in struttura nativa.
Questo perchè lo stacking della struttura ad elica ed i legami ad H tendono a diminuire l’assorbanza.

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17
Q

Cromofori nel visibile

Perchè alcuni cromofori sono in grado di assorbire luce nel visibile?

A

Grazie alla presenza di un gruppo π-coniugato

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18
Q

Sistema π coniugato

Cos’è e come si spiega un sistema π coniugato?

A

E’ un sistema che presenta legami singoli e doppi alternati in questo modo gli orbitali pz si combinano e gli orbitali molecolari risultano delocalizzati, dando vita a transizioni π–>π* a basse energie (Vis).
Ad esempio nel butadiene all’aumentare del numero di atomi di C si ha una maggiore lunghezza d’onda e quindi una inferiore energia di assorbimento e l’intensità dell’assorbanza stessa. Tale fenomeno è spiegabile qualitativamente attraverso un modello di particella in una scatola.

Vedi slide 24 Molecular spectroscopy II

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19
Q

Fotoisomerizzazione

Prendendo come esempio la rodopsina spiega il fenomeno della fotoisomerizzazione

A

La rodopsina può trovarsi in conformazione CIS o TRANS, per passare da una all’altra sarebbe necessario rompere un legame doppio per permettere la rotazione attorno ad esso, ciò non avviene a temperatura ambiente.
Tuttavia passando allo stato eccitato della molecola tramite assorbimento di un fotone essa può decadere in una delle due conformazioni isomeriche.

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20
Q

Dicroismo lineare

Cosa si intende per dicroismo lineare e come si applica alla rodopsina?

A

Un sistema si dice linearmente dicroico quando l’assorbanza dipende dall’orientazione della polarizzazione della luce incidente, questo è comune quando il sistema non è isotropo.
Nel caso della rodopsina i bastoncelli sono orientati tutti in maniera simile e di conseguenza lo sono anche le molecole di retinale (circa ortogonali alla rodopsina), pertanto il sistema non è isotropo e quindi è linearmente dicroico.

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21
Q

Spiega come la rodopsina sia incorporata nel meccanismo della visione

A

Nella retina sono contenuti i bastoncelli formati dalla sovrapposizione di membrane a disco ciascuna delle quali contiene le molecole di rodopsina.
I coni a differenza dei bastoncelli sono selettivi per il colore, questo perchè vari amminoacidi nell’intorno della rodopsina interagendo con il retinale costituiscono un differente circondario molecolare, differenziando l’assorbimento.

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22
Q

Mobilità proteica

Come si può sfruttare il dicroismo lineare della rodopsina per misurare la mobilità delle proteine all’interno della membrana cellulare?

A

Si invia un impulso intenso alla lunghezza d’onda di attivazione della rodopsina, le rodopsine con il retinale orientato parallelamente alla polarizzazione avranno maggior probabilità di transizione e cambieranno conformazione (mentre le altre rimaranno in configurazione nativa); tali molecole avranno anche uno spettro di assorbimento modificato.
Ora si invia luce alla lunghezza d’onda di assorbimento della rodopsina in stato attivato (a tale lunghezza d’onda l’assorbanza della rodopsina non attivata è praticamente nulla, quindi non ci sarà più attivazione di altre molecole), al passare del tempo A// decadrà exp con una certa costante di tempo. Quest’ultima rappresenta il tempo caratteristico con cui le proteine ruotano all’interno della membrana cellulare.

23
Q

Da cosa ha origine il dicroismo circolare?

Rispondi anche a:
Cos’è la forza rotazionale?

A

Si parla di dicroismo circolare quando un sistema ha un coefficiente di estinzione diverso per luce polarizzata circolarmente in base se sia D o L.
Siccome la polarizzazione lineare si può vedere come due polarizzazioni circolari in controfase, inviando su una molecola con dicroismo circolare luce con polarizzazione lineare si ottengono due componenti differenti.
La forza rotazionale ci dice quanto la molecola sia in grado di ruotare la polarizzazione.
Per il calcolo della forza rotazionale vedi slide 8 Biomolecular modelling III

24
Q

Dipolo di transizione magnetico

Qual è la richiesta sugli orbitali molecolari per una transizione per avere un dipolo di transizione magnetico non nullo?

A

Quello che nella transizione gli orbitali molecolari si riarrangino ruotando.

25
Q

CD nelle proteine

Perché il dicroismo circolare è utile nelle proteine?

A

La combinazione dei dipoli di transizione magnetici dei gruppi peptidici nella proteina la rendono circolarmente dicroica. Siccome differenti strutture secondarie avranno un’interazione diversa di questi dipoli di transizione, allora avranno un DC diverso.
Quindi il DC ci permette di distinguere differenti strutture secondarie nelle proteine e in particolare è possibile determinare la percentuale di diverse strutture secondarie in esse.

26
Q

Porfirine

Come si spiega lo spettro d’assorbimento della porfirina?

A

Vedi slides 13-15 Molecular spectroscopy III

27
Q

Emissione fluorescente

  1. Quale è la differenza tra rate di emissione spontanea e stimolata nelle molecole?
  2. Inoltre, come dipende dalla lunghezza d’onda di emissione il rate di emissione spontaneo?
A
  1. Se eccitiamo con un’onda monocromatica una molecola ad uno stato eccitato di S1, questo decadrà al GS di S1 per rilassamento vibrazionale; diminuendo quindi la probabilità del rate di transizione per emissione stimolata. Quindi per le molecole l’emissione stimolata è inferiore di quella stimolata.
  2. Come 1/λ^3, quindi più è alta l’eccitazione e maggiore la probabilità di decadere per emissione spontanea.
28
Q

Regole dello spettro di fluorescenza

Spiega cos’è e perché si verifica lo Stokes shift.

A

Poiché il tempo caratteristico di rilassamento vibrazionale (per cui si ha decadimento al GS del livello eccitato elettronico S1) è molto inferiore (ps) rispetto a quello di emissione spontanea (ns) e quindi decade sempre al GS di S1, pertanto la lunghezza d’onda di emissione è sempre maggiore di quella di assorbimento. La differenza tra i picchi di assorbimento ed emissione è detta Stokes shift.
Più la molecola cambia la sua geometria passando allo stato eccitato e maggiore sarà lo Stokes shift, poiché i minimi del GS e dell’ EX si allontanano sempre di più.

29
Q

Descrivi il processo della visione che coinvolge la rodopsina

A
  • La rodopsina assorbe un fotone e ne consegue il suo cambio conformazionale (da cis a trans), grazie a cui può legare la trasducina (molecola costituita da 3 parti) attivandola.
  • La trasducina in seguito alla sua attivazione rilascia la GDP e Ga a cui si lega la GTP.
  • Ga-GDP si lega alla fosfodiesterasi attivandoola, questa è in grado di rompere la ciclicità della cGMP —> GMP.
  • Il cambio conformazionale della GMP causa la chiusura del canale ionico e la formazione di un potenziale di 1 mV.
30
Q

Regola di Kasha

Spiega cosa si intende per regola di Kasha

A

Lo spettro di emissione è indipendente dalla lunghezza d’onda di eccitazione. Questo perchè:
* Se la molecola è eccitata in uno stato eccitato di S1, allora torna al GS di S1 per rilassamento vibrazionale e decade a S0 da li.
* Se la molecola è eccitata ad uno stato eccitato (o GS) di S2 (o superiore), allora decade a S0 tramite un processo non radiativo di conversione interna (100 ps) e quindi ci riconduciamo al caso precedente.

31
Q

Regola dello specchio

Spiega cosa si intende per regola dello specchio

A

Lo spettro di emissione e di assorbimento sono spesso speculari. Questa regola presenta molte eccezioni (sopprattutto per molecole “flessibili”). La ragioni per cui si osserva ciò sono:
* I sottolivelli energetici vibrazionali della molecola sono spaziati ugualmente in S0 e S1 e quindi i picchi hanno la posizione speculare nello spettro.
* Transizioni di emissione ed assorbimento hanno gli stessi fattori di Frank-Condon e quindi i picchi hanno le **stesse intensità **nello spettro (nell’approssimazione di displacement lineare).

32
Q

Assorbimento, emissione ed eccitazione

Qual è la differenza tra lo spettro di assorbimento, di emissione e di eccitazione?

A
  • Assorbimento: indica quanta luce viene assorbita rispetto a quanta ne viene mandata in ingresso per una certa lunghezza d’onda.
  • Emissione: indica l’intensità della fluorescenza al variare della lunghezza d’onda di emissione (ad una fissata l. d’onda di eccitazione)
  • Eccitazione: indica l’intensità della fluorescenza ad una fissata l. d’onda di emissione al variare della l. d’onda di eccitazione.
33
Q

Anisotropia di fluorescenza

  1. Cosa si intende per anisotropia di fluorescenza?
  2. Quali quantità ci danno indicazione su tale anisotropia?
A
  1. Se una molecola è illuminata da radiazione polarizzata linearmente, le molecole eccitate saranno quelle con dipolo di assorbimento parallelo alla polarizzazione del campo.
    Se la molecola è a riposo, allora anche la radiazione in uscita sarà polarizzata. Se peraltro il dipolo di assorbimento e quello di emissione sono paralleli allora la luce di fluorescenza avrà polarizzazione orientata parallelamente a quella in ingresso.
  2. Vedi slide 3 Molecular spectroscopy IV
34
Q

Tempo di vita

Come si scrive il tempo di vita di fluorescenza?
Qual è la sua relazione con il quantum yield e il tempo di vita radiativo?

A

Vedi slide 5 Molecular spectroscopy IV

35
Q

Fluorescenza del TRP

Come è possibile sfruttare la fluorescenza del TRP per monitorare cambi conformazionali nelle annexine?

A

In presenza dello ione Ca2+ il TRP è posto all’esterno della proteina in contatto con la soluzione; sebbene questo potrebbe far pensare che l’azione di eventuali quencher possano diminuire il tempo di fluorescenza del TRP, in realtà esso è allungato rispetto alla configurazione in assenza del Ca2+. Questo perché in quest’ultima configurazione il TRP è posto all’interno della proteina ed eventuali interazioni con altri gruppi aromatici può causare un trasferimento non radiativo di energia.

36
Q

Fosforescenza

Descrivi il processo di fosforescenza delineando le differenze con quello di fluorescenza.

A

Quando una molecola viene eccitata, invece che decadere in S0 per fluorescenza può effettuare un intersystem crossing passando da uno stato di singoletto ad uno di tripletto T1 ad una energia inferiore rispetto ad S1. Dopodichè può decadere in S0 per fosforescenza, questo decadimento è poco probabile ed ha un tempo di vita nel range s-μs.

37
Q

Photobleaching

Cosa si intende per photobleaching?

A

E’ il passaggio di una molecola da uno stato eccitato ad uno stato dark a causa di una reazione fotochimica.

38
Q

GFP

La maggior parte delle proteine assorbono ed emettono nell’UV, perché la GFP è in grado di farlo nel visibile?

A

Questo avviene perché durante la formazione del cromoforo della GFP ( che non necessita di alcun fattore, ma viene costruito direttamente all’interno della proteina), si ha per ciclizzazione della struttura del backbone proteico (che avviene tramite una reazione di ossidazione ed una di disidratazione), questa porta alla estensione del sistema p-coniugato.

39
Q

RFP

Qual è il principale svantaggio dell’uso della RFP piuttosto che la GFP?

A

La RFP è un tetramero e di conseguenza ha un peso molecolare molto maggiore della GFP, da che ne consegue un maggior ingombro e una minore mobilità.

40
Q

Come e perché lo spettro di assorbimento della GFP dipende dalle condizioni esterne?

A

L’eccitazione del cromoforo della GFP avviene per transizione dall’HOMO al LUMO, questo comporta una modifica della densità di carica e la formazione di un dipolo permanente nello stato eccitato LUMO.
In presenza di proteine nell’ambiente esterno queste possono formare dei legami ad H che vanno a “contrastare” la nascita del dipolo in conformazione LUMO, alzando l’energia necessaria per passare allo stato eccitato assorbendo un fotone.

41
Q

Cromofori isolati

Perché un cromoforo isolato (fuori dalla proteina), ha un quantum yield basso?

A

Il cromoforo possiede dei gradi di libertà torsionali attorno ad alcuni dei suoi legami. Questo gli permette, una volta eccitato, di riarrangiarsi nella conformazione dello stato fondamentale senza emettere radiativamente.
Quindi in assenza di una struttura che limita le sue torsioni la fluorescenza del cromoforo è scarsa.

42
Q

FRET

Cos’è la FRET?
Con quale accortezza vanno scelte le due molecole?
Ripercorri i passaggi per scrivere il rate di trasferimento risonante e l’efficienza di FRET.

A

Förster Resconance Energy Transfer.
Si ha quando due molecole sono sufficientemente vicine e con spettro di emissione del donore che si sovrappone, almeno parzialmente, a quello di eccitazione dell’accettore. In questo modo può avvenire un trasferimento risonante di energia tra lo stato eccitato del donore e quello dell’accettore, il quale decadrà in quello fondamentale emettendo per fluorescenza.
E’ importante scegliere accettore e donore in modo che gli spettri di assorbimento dei due non si sovrappongono, così da non eccitarli contemporaneamente.

Vedi slide 27-32 Molecular spectroscopy IV

43
Q

Scattering

Quali regimi di scattering si possono distinguere in base alla dimensione del centro scatteratore?

Quale luce tra rossa e blu penetra meglio i tessuti?

A
  • Rayleighh scattering: quando la particella ha dimensioni trascurabili rispetto la l. d’onda, l’intensità della radiazione scatterata va come ω^4.
  • Mie scatering: se le dimensioni del centro scttertore sono comparabili con quelle della l. d’onda, l’intensità della luce scatterata è all’incirca indipendente dalla frequenza.

La luce rossa penetra meglio i tessuti perché ha una lunghezza d’onda maggiore e quindi un coefficiente di scattering inferiore.

44
Q

Assorbimento a 2 fotoni

Quali sono le principali dipendenze del rate di assorbimento di 2 fotoni?

A

Vedi slide 8 Molecular spectroscopy V

45
Q

1 PA vs 2 PA

Quali sono le differenze tra la sezione d’urto, il rate di eccitazione e gli spettri di assorbimento/emissione degli assorbimenti a singolo e doppio fotone?

A

Vedi slide 9 Molecular spectroscopy V

46
Q

Spesso spettri di assorbimento a singolo fotone e di eccitazione a due fotoni presentano picchi in punti diversi dello spettro.
Quali sono gli elementi che spiegano questo diverso comportamento?

A

Vedi slide 12 Molecular spectroscopy V

47
Q

2ph. confocale

Cosa si intende quando si dice che l’eccitazione a due fotoni è intrinsecamente confocale?

A

Siccome l’eccitazione a due fotoni va con il quadrato dell’intensità (a differenza di quella a fotone singolo, che ha una dipendenza lineare), l’intensità di fluorescenza decadrà più rapidamente fuori dal piano focale, mentre per quella a singolo fotone la fluorescenza si avrà anche per piani diversi da quello focale.

48
Q

Vantaggi di 2ph

Quali sono i vantaggi e svantaggi dell’usare l’eccitazione a 2 fotoni piuttosto che quella a singolo fotone?

A

Vantaggi:
* Migliore penetrazione del campione per via della trasparenza della luce rossa e near-IR dei campioni biologici.
* Non è necessario l’uso di un pinhole nella microscopia confocale
* Ridotta fototossicità visto che si usano luce ad una energia inferiore e ridotto fotobleaching vista l’intrinseca confocalità.

Svantaggi:
* E’ necessario l’uso di un laser ad IR
* La sezione d’urto e quindi la probabilità di eccitazione è più bassa, questo richiede un’intensità maggiore e quindi, per non danneggiare il campione, un laser impulsato
* Visto l’utilizzo di una lunghezza d’onda doppia, anche la risoluzione è dimezzata.

Nota: l’uso del laser impulsato fa una differenza solo grazie alla dipendenza della fluorescenza a 2ph come I^2. Questo permette di raggiungere picchi di intensità molto alti che decadono rapidamente, non alzando troppo la potenza media fornita al campione.

49
Q

II armonica

Come avviene la generazione di II armonica?
Cosa si può dire sulla condizione per somma coerente dei contributi di II armonica?

Sia in molecole che in bulk

A

Vedi slide 19-20 Molecular spectroscopy V

50
Q

Quali sono i vantaggi dell’uso del segnale di II armonica?

A
  • E’ endogeno e quindi non richiede nessun fluoroforo
  • Photobleaching e fototossicità ridotta
  • Confinamento dell’eccitazione e migliore penetrazione del tessuto biologico (come per la 2ph.)
  • Dipendenza quadratica dalla concentrazione degli emettitori (frutto del fatto che è un processo di somma coerente di due contributi)
51
Q

Qual è una condizione necessaria sulla struttura dei tessuti biologici su cui viene effettuato imagin di II armonica?

A

Che la struttura sia ordinata gerarchicamente, come ad esempio nel collagene, microtubuli etc..

52
Q

Come mai è necessario un certo livello di integrazione nel meccanismo della visione?

A

Il segnale di 1 mV è innescato dalla semplice isomerizzazione della rodopsina, tuttavia questo può avvenire in un tempo scala molto lungo anche spontaneamente. Ma, visto il grande numero di molecole di rodopsina nei bastoncelli, questo evento non è affatto raro. Pertanto è necessario un certo livello di integrazione perché il segnale non venga filtrato (5-14 eventi di polarizzazione simultanea).

53
Q

Guardando la tabella alla slide 7 di Molecular spectroscopy IV: da cosa è dominata la grande differenza del quantum yield della fenilalanina?

A

Mentre i rate di ricombinazione non radiativa sono molto simili tra loro, quelli radiativi sono quelli più rilevanti per il QY essendo quelli che differiscono di più (a causa dei diversi coefficienti di estinzione credo…).