Sistemas de expresión I Flashcards
Transcripción
- Sigma busca a promotor
- Nucleo de enzima a sigma
- Formación de complejo DNA-RNA
- RNAP desenrolla DNA
- RNAP inicia crecimiento de cadena
- Se elonga cadena
Partes de un vector de expresión
Promotor, sitio de unión al ribosoma, MCS, terminador, ori, marcador
¿Qué es el promotor?
Secuencia que recluta elementos necesarios para hacer transcripción
Un promotor puede ser…
Debil o fuerte. Constitutivo o inducible
Sistema de expresión basado en promotor T7
Fuerte, nivel de expresión alta. Utiliza cepas como BL21. MAT
Sistema de expresión basado en pTrc
Fuerte, inducido por IPTG y reprimido por lacI
Vector de expresión basado en pBAD
Sistema muy regulado. Controla cantidad de proteína producida. Util si se expresen proteinas toxicas para hospedero
Ventajas de sistemas de expresion bacterianos E.Coli
Expresión rápida, alto rendimiento, facil de cultivar, barato, produccion rapida y costo-efectiva
Desventajas de sistemas de expresion bactieranos E.Coli
Proteinas con puentes disulfuro son dificiles de expresar. Produce proteínas no glicosiladas. Formación de acetato (tóxico para celula). Cuerpos de inclusión. Requiere replegamiento
¿Como mejorar produccion de proteinas en E. Coli?
Cambiar medio de cultivo, utilizar diferentes primers, coexpresar chaperonas, disminuir temperatura, renaturalizar proteina, reducir velocidad de sintesis
Alta cantidad de proteina es producida en….
Citoplasma
Proteínas citoplasmaticas pueden ser exportadas a….
Al periplasma por medio de un peptido lider en N-terminal
¿Por qué es mejor el periplasma que citoplasma?
Pues se simplifica purificación y facilita el plegamiento correcto
Como incrementar producción de proteína
Utilizando sistema de promotor muy regulado
Ventajas de secretar proteinas en periplasma
Facilita recuperacion. Plegamiento y estabilización in vivo. Se producen proteinas solubles y se disminuyen costos
Sistemas de expresion Bacillus
Gram +, para expresar proteasas y amilasas, cepas de uso industrial.
Ventajas de Sistemas de expresion Bacillus
Altos niveles de secrecion. no cuerpos de inclusión. facil manipulación. bajos costos. GRAS. Tecnología desarrollada
Principal produccion con Bacillus
Subtisilina, Proteasa neutra, ISP I, ISP II
Cepas de B. licheniformis
GMO, forma esporas, expresion alta, poca perdida, mayor rendimiento si se remueve gen de alfa-amilasa
Cepas de B. brevis
Baja actividad, produce inhibidor de proteasas.
Proteinas homologas producidas por bacillus
Xilanas, Naproxen, Amilasas, Proteasas
Proteinas heterologas producidas por bacillus
Interleucina, esterasa de Pseudomonas
Sistemas de expresion Lactoccocus lactis
Gram +, GRAS, aplicacion alimentaria y terapeutica, forma cuerpos de inclusion a mejores niveles
Sistemas de expresion Pseudomonas fluorescens
No requiere aeracion alta, no se acumula acetato. Problema al formar puentes disulfuro y plegando
Sistemas de expresion Streptomyces lividans
Secretan mucho, carece sistema de restriccion. Bajo nivel de proteasas. Bajo nivel de produccion
