E.Coli como célula huésped Flashcards
¿Cómo se ocupa E. Coli?
Como hospedero para propagación y manipulación de DNA recombinante
¿Cuál es el principal beneficio de E.Coli?
Su alta velocidad de crecimiento
¿Cuál es la E.Coli original?
E.Coli K-12, provenie de un paciente con difteria
E.Coli B
Se derivan cepas como REL606 y BL21
E.Coli C
diferencias morfológicas
E.Coli W
Aislada por Selman Waksman
recA, recB, recC, recD
Recombinación
rpsL(Str r)
Resistencia a estreptomicina
lacI q
Mutación constitutiva
Propiedades Generales de hospederos para clonación
Imposibilidad, Fertilidad, Sistemas de Modificación metilación-restricción, Sistemas de recombinación, sistemas de alfa-complementación
Imposibilidad
Se genera codón STOP. ambar (UAG), ocre (UAA)
Fertilidad
En celulas HFR, el factor F causan transferencia. Mutacion en tra provoca transferencia. Las cepas con factor F generan pili.
Sistemas de modificación-restricción
Evita intercambio genético, destruyendo ADN foráneo
Sistema de ADN metilasa
Metila residuos de C/A evitando degradación
Dam
metila residuos de A en GATC
Dcm
metila residuos de citosina en CC(A/T)GG
Que cepas siempre son dam+
recA-
¿Qué podría causar Dam o Dcm?
Afectar digestión de DNA clonado, afectar eficiencia de transformación, ocasionar mutagénesis
hsdR- resulta en?
fenotipo de restricción y metilación negativo
hsdS
deficientes en metilación
hsdR
codifica endonucleasa
hsdM
codifica metilasa
hsdRMS
subunidad del sitio reconocimiento
McrA, McrB
cortan metilcitosinas
Mrr
Corta metiladenina
Si utilizas metilasas de citosina en clonación
ADN recombinante debe ser transformado en mcrA-, mcrBC- para que no haya restricción de Mcr
Recombinación
Mutaciones pueden mantener integridad de DNA clonado
Vías de recombinación de E. Coli
recBCD, recE, recF
recA-
reduce recombinación hasta 1000 veces
recBC- y recd-
buenos hospederos para estabilizar palindromes de vector lambda
RecBCD
degradan ADN concatamerico lineal entonces ocupar recBC, sbcB-, recD-
Mutaciones en mutD provoca
Mutaciones espontaneas
Mutagénesis al azar
Mantener a plásmidos en mutD- y luego transformar en mutD+