Séquençage nouvelle génération Flashcards
Combien de liaisons entre les nucléotides C - G eet A - T ?
Quelle est la paritcularité de la libraire des NGS ?
Comment se classe les variants ? (5)
- Trois liaisons entre C et G et deux entre A et T.
- Préparation d’une librairie : on va multiplexer un nombre important de
panel ou de régions : centaines de couples d’amorces qui vont pouvoir amplifier plus d’une centaine voir plus de milliers de régions différentes. En une technique, on peut faires les 30 gènes d’une maladie et les séquencer en même temps. - On va classer les variants en pathogène / probablement pathogène / signification inconnue (gros pourcentage) / probablement bénin / bénin
Quelles sont les étapes des NGS 1ère et 2eme génération ?
Quelle étapes sautent avec les NGS de 3ème génération ?
Pour les premiers et deuxième génération :
- Préparation de banque, de librairie d’ADN
- Puis une étape d’amplification
- Puis une étape séquençage
- Pour finir, il existe une grande étape d’analyse informatique des données.
3ème génération :
- Sans les étapes avec possibilité de biais : préparation de banque et d’amplification. On part directement de l’ADN.
Quelles tailles de fragments d’ADN chaque technique permet-elle de séquencer ?
1ere génération : Sanger, permet l’analyse de fragments courts d’ADN (500 – 1000pb)
2e génération : Séquençage avec librairies de fragments courts en parallèles (50 – 500pb) mais beaucoup plus nombreux
3e génération : dernière génération disponible, on part de l’ADN. Possibilité d’analyser des fragments beaucoup plus longs (10kb) mais fait encore beaucoup d’erreur car séquence de grands brins. En génétique humaine, peu utilisé. Mais plus rapide, utilisé en virologie (plus petit avec moindre risque d’erreur)
2 principaux constructeurs :
Deux constructeurs sont leaders (2e génération) sur le marché avec des technologies différentes :
- ILLUMINA : développement de réactif, très ouvert sur le marché et tous les autres fournisseurs. Se rapproche d’un séquençage de type Sanger.
- ION TORRENT : utilisation de puces adaptables à la taille des fragments d’étude.
Quels sont les 2 paramètres prendre sur les séquences que l’on veut séquencer ?
- *Panel et taille du panel :**
- Design (= choix) des cibles intéressantes qu’on veut avec impact théranostique. La taille du panel correspond à la taille d’amplicon (technique Ampliseq) : accumulation des régions qu’on veut dans un panel. Cela va nous donner une taille de panel en Kb, conditionne le nombre de patients qu’on pourra passer sur la machine selon capacité de la machine
Applicatif : on va vouloir avoir une profondeur. On est sur du somatique : en effet, pour la tumeur, on n’est jamais 100% tumeur avec possibilité de contamination par « du normal ». Les clones ne sont pas toujours homogènes avec minorité et majoritaire. On essaie d’avoir des techniques qui descendent de plus en plus bas car on veut une image réelle des différents clones : on peut avoir 3% de cellules tumorales (de fréquences alléliques), dès fois on arrive à descendre à 1%. La limite validée de manière reproductible reste 3%.
En somatique combien de fois veut-on reader chaque région ?
Qu’est ce que le coverage ?
En somatique, on veut reader 500x pour chaque région pour sortir du bruit de fond (chaque région doit être séquencer 500 fois). En pratique, on read à 2000.
Le coverage qui correspond sur un panel donné, au design qu’on a décidé pour avoir une couverture de 100% (100% des régions séquencées de A à Z) puis la profondeur : Deep (combien de fois on veut séquencer)
Résumé :
Panel = amplicons choisi (avec impact théranostique)
Taille du panel : en Kb, taille de la somme des amplicons
Profondeur (applicatif, deep) : % nécessaire d’ADN tumoral (3% minimum en pratique)
Coverage : séquencer toute les bases des amplicons
Combien de fois veut-on séquencer pour de l’ADN circulant ?
Quel risque augmente plus on séquence un grand nombre de fois ?
Quels techniques permettent d’y arriver ?
Pour l’ADN circulant tumoral, on veut séquencer 20 000x pour sortir du bruit de fond du plasma.
Plus on descend et plus il y a de risque d’artéfacts
Nécessite PCR digitale ou technique NGS modifiée pour descendre très bas sans la problématique d’artéfacts.
En fonction des besoins, du panel, de l’applicatif etc… on va choisir les machines (3) :
ILLUMINA : moins on passe de patient et plus c’est cher. En fonction de la machine, les temps de séquençage vont être plus ou moins long mais beaucoup plus de datas.
Chaque machine est adaptée à un usage. Se rapproche d’un séquençage de type Sanger.
ION TORRENT : fonctionnement basé sur des puces. Sur une même machine, on aura des puces de taille différentes. On pourra passer différents panels en routine. Délais de séquençage plus courts.
3E GENERATION : par exemple, MinION. Longueurs de reads très élevés mais taux d’erreur plus important avec prix élévé. Ne séquence pas profond
Quelles sont les grandes étapes du NGS ? (6)
Extraction de l’ADN : manuelle sur colonne de silice ou automatisée via des billes magnétiques. On extrait selon type de tissus : FFPE, congelé , cellule, LCR (si métastases méningées), ascite, liquide pleural (beaucoup de cellules, on peut trouver des fusions). Doit être validée : quantité / qualité d’ADN/ARN
Choix du panel d’amorces : commercial/custom
Préparation de Librairies (ou banques)
Amplification par : PCR Emulsion / PCR en pont (en fonction de la machine)
Séquençage qui génère des signaux : Fluorescent pour Illumina (comme sur le Sanger) / Luminescent pou Ion torrent (détecter les liaisons H+ différentes selon les bases)
Analyse informatique : au départ, première étape de data brutes puis analyse secondaire qui va annoter les variants. Pour finir, troisième étape : prédiction de pathogénicité avec vérification des bases de données
2 choix de librairie possibles ?
- Par amplicons : certains vont bien marcher dans un design, d’autre non :
amplifiabilité de l’ADN très variable. Peu consommateur d’ADN. Souvent choisie pour les tumeurs solides FFPE.
- Par capture : le mieux. On fait une pré-étape où on capture des régions d’intérêts, on enlève déjà ce qu’on ne veut pas avec bonne homogénéité des reads. Plus de gènes possibles. Plus consommateur d’ADN.
NGS en Illumina :
Comment se prépare la librairie ?
Quelles étapes sur la méthode de séquençage ?
Préparation de la librairie (par capture) :
- Amplification par PCR des séquences d’intérêt (par des sondes)
- Ajout d’un index = barecode, spécifique à chaque patient/échantillon
- Ajout adaptateurs P5 et P7 qui permettent l’hybridation sur la flow cell en verre.
Amplification :
- Hybridation de l’amplicion sur la flow cell
- Synthèse du brin complémentaire
- Dénaturation, brin complémentaire reste fixé
- L’extrémité libre de l’amplicon s’hybride sur un autre oligo de la flow cell
- Synthèse du brin complémentaire
- Dénaturation, les 2 brins sont fixés
etc. .. => amplification du signal.
Séquençage :
- Par nucléotides “réversibles terminator” fluorescent : photo après chaque cycle d’incorporation de base => séquençage base après base : entre 1.5 et j.
NGS en Ion Torrent :
Quels avantages ?
Préparation de la librairie ?
Amplification ?
Avantages : petite quantité d’ADN, adaptabilité des tailles de puces, temps de run et d’analyse court.
Préparation de la librairie :
- Amplification par PCR via Primer choisi, des séquences d’intérêt
- Ajout d’un barecode spécifique de chaque échantillon/patient
- Ajout adaptateur permettant l’hybridation dans la bille
- Purification : retrait des enzymes etc…
- Normalisation
Amplification clonal (et pas en pont comme Illumina) :
- Emulsion d’une goutte huile/eau avec une bille avec un index : forme un réacteur
- On ajoute un peu d’ADN, on essaye qu’il y ait une séquence d’intérêt par bille.
- Tout ce qui n’est pas 1 bille avec 1 séquence ADN est jeté (bille seul, bille + pls séquences ADN, 1 séquence et pls billes)
- Amplification sur la bille d’ADN avec séquence P1 attachée à la bille et A libre via amorce ePCR-P1 ou ePCR-A
NGS Ion Torrent :
Séquençage ?
Les puces sont semi-conductrices et l’ionogramme va les détecter. Modification d’un H+ avec modification du pH proportionnelle au nombre de nucléotides ajoutés.
Quelles applications cliniques ? (3)
-
Génotypage : 5 à 2% de sensibilité avec biopsies ou pièces opératoires FFPE ou ADN tumoral circulant (0,1%)
=> Mutations de résistance / Sensibilité aux traitements / de toxicité : EGFR, ROS, ALK, MET …. - Recherche de transcrit de fusion ( 1% de sensibilité) sur biopsie ou pièces opératoires
- Copy number variation (CNV) : cibles thérapeutiques ou pronostiques
Quelles sont les 2 possibilités pour rechercher de l’ADN circulant ?
Quelle quantité de sang minimum ?
- Utilisation des mêmes panels que le NGS « classique » avec risque de faux positifs liés aux artéfacts
- Utilisation du Tag sequencing (UMI) : on va mettre un code-barre spécifiquesur chaque molécule d’ADN, puis amplification et séquençage. Permet une correction de l’erreur via UMI : détection du variant 5 fois pour 30 UMI = pas pareil que 30 fois pour 30 UMI > permet donc de différencier un vrai variant d’un artefact. À la fin, on peut dire le nombre de molécules d’ADN avec le variant
- 4mL de sang
