Méthylation et cancérogenèse bronchopulmonaire

Question 1

Les altérations du gènome peuvent-elles éxpliquer les variabilités phénotypiques ?

Answer 1

• Non

Génome très stable, hérité par les cellules filles lors de la réplication.
Mutations qu’on peut observer : rares, variants de la normale sans implication dans la majorité des cas.

Ce n’est donc pas l’altération du génome qui explique la variabilité phénotypique

Question 2

La compaction de l’ADN est un élément important de l’épigénétique :

Longueur du brin d’ADN / taill du noyau ?

L’ADN s’enroule autour de quelles structures ? De quoi sont-elles composées ?

Combien de bases peuvent s’enrouler ?

Answer 2

La cellule contient un brin de 2m de longueur et le noyau de la cellule fait 10µm. Il faut que l’ADN rentre dans le noyau par phénomène de compaction de l’ADN.

L’ADN s’enroule autour de structures sphériques : nucléosome (octamère d’histones)

Question 3

Quelles modifications peuvent avoir lieu sur les histones ? (3)

Dans quel but ?

Est-ce transmissible ? Est-ce réversible ?

Answer 3

• Acéthylation, Phosphorylation et Méthylation
• Pour aboutir à l’ouverture ou fermeture de la zone d’ADN concernée
• Oui, oui

Question 4

Qu’est ce que l’Exposome ?

Answer 4

Ensemble des facteurs auxquels sont exposés les êtres pluricellulaires modifiant les
régulations épigénétiques mais beaucoup moins d’influence sur le code génétique en luimême.

Question 5

Quelles enzymes modifient les histones ?

Answer 5

Histone acétylase ou desacetylase / méthylase ou déméthylase.

Question 6

La méthylation a lieu sur quelle base ?

Se fait fait-elle selon un pattern hasardeux ?

Exemples de rôle de la méthylation ?

Answer 6

- Cytosine : CH3 en position 5 du noyau carboné de la cytosine

• La méthylation de l’ADN non répartie aléatoirement mais de manière très déterminée avec une empreinte génomique qui correspond à un pattern de méthylation de l’ADN spécifique à chaque individu.
  On peut identifier un humain sur son empreinte de méthylation de l’ADN :
  très forte en terme de régulation des gènes, extrêmement stable au cours de la vie.

La méthylation de l’ADN :

• Détermine l’inactivation du chromosome X chez les hommes
• Rôle important également dans le développement cellulaire normal
• Contrôle de l’expression de gènes tissus spécifiques
• Contrôle la croissance cellulaire, l’entrée dans le cycle cellulaire et l’instabilité génomique

Question 7

Quelles sont les 3 catégories d’enzymes autour de la méthylation ?

Quelle réaction chimique pour aboutir à la méthylation ?

Quelle conséquence de la méthylation de cytosine sur l’expresison du gène ?

Answer 7

3 grandes catégories d’enzyme :

• DNMT1 : DNA Methylation Maintenance
• DNMT3A/B : De Novo DNA Methylation dans des situations particulières exprimées (régulé par éléments intrinsèques et extrinsèques)
• TET1/2/3 : demethylation, rôle en physiologie et pathologies
• Réaction chimique : SAM-CH3 utilisé par DNMT pour fixer le CH3 en position 5 sur la cytosine
• Méthylation cytosine => répression expression de gène car ADN condensé.

Question 8

Quelles zones particulières sont spécialement méthylées ?

Quels éléments souvent méthylés dans les cellules cancéreuses ?

Answer 8

Ilots CPG = succession Cytosine et Guanine : zone du génome où se fait la méthylation de l’ADN.
La densité des zones zones de CPG vaire : CPG shore, CPG shelf encore moins de CPG et Open sea : très peu d’ilots de CPG et très peu de méthylation.

• Cellules cancéreuses: méthylatins de promoteurs de gènes suppresseurs de tumeur => silencing du gène

Question 9

Quel procédé permet de repérer les cytosine méthylée ?

Quelle technique permet de le faire à grande échelle ?

Answer 9

La conversion bisulfite :
- La cytosine est convertie en uracile en exposant l’ADN à du sodium bisulfite => si la cytosine est méthylée il n’y pas de conversion => on démasque les cytosine méthylée

Lors d’une amplification par PCR, l’uracile est remplacé par une Thymidine => au séquençage s’il y a une Thymidine à la place d’une cytosine c’est qu’elle n’était pas méthylée

Sur plateforme Illumina facile d’accès
Elle permet de regarder 850 000 positions CpG dans le génome.
On peut partir d’un prélèvement fixé au formol, à partir de fluide type épanchement, …
Le formol fractionne l’ADN, on aura des millions de petits fragments d’ADN mais pour faire la séquence de méthylation il faut des séquences d’ADN relativement longue > 250ng.
=> technique de religation de l’ADN pour faire un brin d’ADN long pour la technique puis conversion bisulfite. On le met sur une puce et c’est analysé par plateforme illumina.
À la fin, 850K position CpG représentée sur Heatmap, notion quantitative de méthylation de l’ADN. Reproductible et peu couteuse, un grand nombre de position CpG des prélèvements analysés.

Question 10

1 carcinogène du tabac, associé à l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs : P53/P16 ?

Est-ce un mécanisme on/off ?

1er modèle montrant le rôle de la méthylation dans la carcinogenèse ?

Answer 10

• Nitrosamine 4-(methylnitro-samino-)1- (3-pyridyl-)-1-butanone
  associé à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs : P53 et P16.
• Non il faut un processus multi-étapes
• Gène p16INK4A ou CDKN2A qui a rôle prolifératif important.
  Si perte de fonction, on aboutit à une cellule qui perd le contrôle du cycle cellulaire.
  La méthylation des ilots CpG des promoteurs de CDKN2A est lié à la carcinogenèse. Plus la méthylation est importante (CDKN2A), plus la lésion pulmonaire est agressive : perte de fonction. Progression de la carcinogenèse : Hyperplasie -> in situ -> Epidermoide

Question 11

Dans des modèles de CE et ADK l’augmentation de la méthylation des gènes suppresseurs de tumeur va de paire avec l’agressivité (in situ -> ADK invasif)

Question 12

La carcinogenèse lié au tabac est liée à la méthylation ou la déméthylation ?

Answer 12

Gens qui fument encore, déméthylation associé à la carcinogenèse dans ce cas.
Quand on arrête de fumer, risque diminuer de cancer lié à une reméthylation

Seul 11% des fumeurs font un cancer et l’aspect multi-étapes entre Hyperplasie et cancer invasif : soutien les phénomènes épigénétique. Cela n’aurait pas lieu avec un phénomène mutationnel simple.

Question 13

De très nombeux mécanismes sont régulés par l’épigénétique

Answer 13

• Résistance à l’apoptose
• Echappement à limitation de croissance
• Prolifération
• immortalité
• EMT
• Echappement immunitaire

Question 14

Le méthylome permet-il de différencier une cellule tumorale, d’une cellule normale ?

Answer 14

Avec le méthylome, on peut quasiment identifier si un tissu est normal ou cancéreux.
Différence très importante en termes de méthylation de l’ADN entre ces deux tissus

Question 15

Le transcriptiome varie-t-il en fonction du méthylome ?

Answer 15

Oui, Lien étroit entre méthylation de l’ADN et transcription des gènes.
On a une corrélation réelle. En fonction de la différence de
méthylation, on a une modification réelle de l’expression des gènes.

Question 16

Le méthylome peut-il avoir un impact pronostic ?

Answer 16

Plusieurs phénotypes notamment ultra-méthylé associé à un
pronostic et caractéristiques particuliers : permet d’identifier un sous-groupe de tumeurs bien spécifiques

Question 17

Les miRNA jouent-ils un rôle dans l’épigénétique ?

Comment est contrôlé leur expression ?

Answer 17

• Oui, ils sont un mécanisme épigénétique dans la régulation des gènes.
• Leur expression est elle-même contrôlé par méthylation

Donc la méthylation régule également des mécanismes épigénétiques

Question 18

Méthylation et gène ectopique :

Answer 18

La méthylation ADN peut aboutir à l’expression de gènes ectopiques. Dans les cancers poumons : on retrouve des gènes ectopiques du testis, placenta.

Lien direct entre identification des gènes ectopiques : méthylation et expression de ces gènes associés à un plus mauvais pronostic : résistance chimiothérapie et immunothérapie.

Question 19

Méthylation et biomarqueur ?

Answer 19

Stratification pronostique des tumeurs ?
Étude JCO en 2013 : on peut établir des signatures pronostiques de méthylation, intérêt majeur pour prédire pronostic du patient : adjuvant par CT ou non.
Pas d’application en clinique pour le moment.

Question 20

Rationnel en faveur des agents déméthylants ?

Answer 20

Agents méthylants avec rationnel très fort pour les tumeurs solides :
- Diminution de capacité métastatique ou EMT
- Diminution des capacités de prolifération, impacter la capacité de
survie
- Augmente l’apoptose, augmente sensibilité CT
- Augmente réponse à l’IOT par expression de gènes très antigénique
- Diminution des phénotypes Stem cells : résistance au TTT dans les
formes métastatiques

Question 21

Sont-il efficaces ? pourquoi ?

Answer 21

Rationnel très fort mais résultats décevants. Combinaison avec d’autres
drogues, taux de réponse décevants avec SG très peu encourageante.

Ils ont un très mauvais index thérapeutique : toxicité hématopoïétique importante avec des doses testées inadéquates.

Mais quelques essais de combinaisons d’épidrogues avec survie prolongée : effet retard ? ou synergie ? ou alors immunomodulation

Question 22

Quel mécanisme de méthylation dans la résistance au immonuthérapie ?

Answer 22

Immunothérapie:

• => effet à long terme avec un lymphocytes T memory qui peuvent se réactiver au cours du temps pour détruire les cellule tumorales qui réémergeraient.
• L’émergence de Lymphocytes Th1 cytotoxique activé sont contrôlés par des mécanismes épigénétiques.

Méthylation :

• CXCL9/CXCL10 vont voir leur transcription reprogrammée avec DNMT1 -> méthylation : => diminution Th1. On a une modification du phénotype Th1 et infiltration.
• Le passage de LcT naif en mémoire se fait via le gène FOXP1 qui régule l’acquisition du phénotype memory. S’il est déméthylé => meilleure survie.

On sait que les intéractions entre cellules tumorales et cellules immunitaires commandés par l’épigénétique : expression PD1, PDL1, même chose pour les protéines du CMH, interactions entre cellules tumorales et Lc NK, activation Lc CD8 Treg.

Question 23

Sur quel principe se base le projet EPIMMUNE ?

Quels objectifs ?

Quel profil Epimmune positif ?

Answer 23

Possible d’anticiper le résultat de l’immunothérapie en de la méthylation de l’ADN

Objectifs :

• Corréler cette signature à l’efficacité des anti PD1,
• Identifier des gènes d’intérêts réprimés ou réexprimés,
• Corréler le profil de méthylation à l’expression PDL1 et CD8
• Tenir compte de l’hétérogénéité tumorale par processus de déconvolution

Epi-immune positif : gène liés à l’inhibition beta catnin pathway, defficient dna repair, activation of IFNgama pathwy, enrichissement en CD4, T cells, CD8 +alpha/béta central memory T cell, NK cell => meilleure réponse à l’immunothérapie

Epi-immune négatif : profil avec macrophages, neutrophiles, fibroblates tumoraux => résistance à l’immunothérapie

Question 24

Conclusion

• Méthylation de l’ADN : rôle important dans la biologie du cancer du poumon
• Applications cliniques potentielles multiples
• Absence de biomarqueurs / thérapies en routine mais pourrait arriver potentiellement
• Nécessité des techniques à haut débit : biomarqueurs prédictifs, mécanisme de résistance, étude du microenvironnement
• Nécessité d’une approche multiomics avec potentiellement le rôle de l’intelligence artificielle