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BCM 1521 > Séparation par chromatographie > Flashcards

Séparation par chromatographie Flashcards

1
Q

Que doit-on utiliser pour faire une chromatographie?

A

Une phase mobile, qui contient le mélange de substances à
fractionner, et une phase stationnaire, au travers de laquelle les substances sont
séparées.

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Q

Qu’est-ce qui ralentit la migration selon les propriétés respectives de chaque substance?

A

L’interactions avec la phase stationnaire.

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3
Q

Quels sont les propriétés du fractionnement cellulaire?

A
  • les interactions ioniques
  • la taille
  • la spécificité
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4
Q

Quels sont les trois types de chromatographies?

A

Chromatographie par échange d’ions, chromatographie par gel-filtration, Chromatographie d’affinité.

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5
Q

V/F Un échangeur de cations porte des groupes chargés positivement et lierait des cations de manière réversible.

A

Faux, porte des charges négatives

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6
Q

Quels sont les classes d’échangeurs?

A

Fort, faible

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7
Q

Un échangeur fort reste chargé à quel pH?

A

entre pH ~ 3 et ~ 10

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8
Q

Un échangeur faible reste chargé à quel pH?

A

Dans une gamme de pH plus restreinte

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9
Q

Est-ce que les protéines peuvent lier à la fois un échangeur d’anion ou de cation?

A

Oui

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10
Q

Que ce passe-t-il dans un processus d’échange d’ions?

A

Les ions liés électrostatiquement à un support insoluble (R) sont remplacés de manière réversible par des ions en solution.

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11
Q

L’affinité avec laquelle une protéine se lie dépend de quoi?

A

du pH de la solution, de la nature et des concentrations des autres ions en solution.

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12
Q

Pourquoi l’affinité avec laquelle une protéine se lie dépend du pH?

A

Puisque la charge nette des protéines varie selon le pH.

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13
Q

Pourquoi l’affinité avec laquelle une protéine se lie dépend de la nature et des concentrations des autres ions en solution?

A

Parce qu’ils vont aussi
compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions.

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14
Q

Qu’est ce qu’une matrice?

A

Sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes. Ces polymères sont suffisamment poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l’extérieur de la bille.

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15
Q

Qu’appel-t-on des résines?

A

Polymères insolubles préparés sous formes de billes.

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16
Q

Quelles est la résine la plus souvent utilisée?

A

Les polysaccharides.

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17
Q

De quoi dépendent les échangeurs?

A
  • La nature de leur matrice.
  • Le type de groupement fonctionnel
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18
Q

Quels sont les quatres groupements fonctionnels sur la matrice?

A

QAE(amine quaternaire),
Sulfonates,
DEAE(amine tertiaire) , CM(carboxyméthyle)

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19
Q

Quel type d’échangeur est le QAE?

A

(N+ pKa ~ 9.5) → échangeur anionique fort.

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20
Q

Quel type d’échangeur est le sulfonate?

A

Échangeur cationique fort.

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21
Q

Quel type d’échangeur est le DEAE?

A

Partiellement chargé à partir de pH 7 à 8 → échangeur anionique faible.

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22
Q

Quel type d’échangeur est le CM?

A

Pleinement chargé à partir de pH 4.5 → échangeur cationique faible.

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23
Q

Quelles sont les trois étapes du principes d’opération de la chromatographie à échange d’ion?

A

liaison à la colonne, lavage, élution.

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24
Q

Comment les protéines se lie à la colonne dans la chromatographie à échange d’ions?

A

Protéines se lient aux échangeurs par des forces électrostatiques. La protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle
doit déplacer.

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25
Q

Qu’est-ce qui fait en sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ion?

A

Le pH et la concentration saline de la solution.

26
Q

Comment fait-on le lavage dans la chromatographie à échange d’ions?

A

La colonne est lavée avec une solution tampon.

27
Q

Que se passe-t-il lors du lavage dans la chromatographie à échange d’ions?

A

Les protéines ayant une affinité relativement faible pour l’échangeur d’ions migreront plus rapidement dans la colonne que celles qui lient l’échangeur avec une plus forte affinité.

28
Q

V/F Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est faible, plus la migration sera retardée.

A

Faux, plus l’affinité est forte.

29
Q

Comment procède-t-on à l’élution dans la chromatographie à échange d’ions?

A

Éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage => procédé d’élution fractionnée.

30
Q

Normalement qu’est-ce qui est utilisés pour l’élution?

A

Le KCl ou le NaCl.

31
Q

Que se passe-t-il lorsqu’on utilise le KCL ou le NaCl pour l’élution?

A

le sel déplace directement la protéine; les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine.

32
Q

Qu’est-ce que l’élution par gradient?

A

l’utilisation d’un gradient linéaire,
où la concentration saline de la solution d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne.

33
Q

Qu’est-ce que l’élution par gradient permet de faire?

A

Libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions selon leur affinité.

34
Q

Dans la chromatographie par gel-filtration par quoi sont divisé les molécules?

A

Leur taille et leur forme.

35
Q

Que contient la phase stationnaire dans la chromatographie par gel-filtration?

A

Consiste en un réseau de polymères insoluble réticulé possédant des pores, fabriqué sous forme de billes.

36
Q

Que permet la grandeur des pores de la résine lors de la chromatographie par gel-filtration?

A

La pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille => la limite d’exclusion.

37
Q

V/F Les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes.

A

Vrai

38
Q

Quelle est la limite d’exclusion des billes de gel?

A

Varieront de 0.8 à 800 kDa pour le Sephadex, et jusqu’à 40 000 kDa pour le Sepharose.

39
Q

Qu’ont les meilleurs billes de gel?

A

Des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes.

40
Q

De quoi dépend la porosité du gel?

A
  • de la masse moléculaire du polymère
  • du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontages)
41
Q

Qu’est-ce que le volume d’élution d’une protéine?

A

C’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne.

42
Q

Que permet de faire le volume d’élution relatif?

A

Estimer la masse moléculaire d’une protéine dans le graphique de volume relatif en fonction du logarithme de la masse moléculaire des protéines éluées.

43
Q

Que permet de faire la dialyse?

A

Séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines.

44
Q

À base de quoi sont faite les membranes utilisée lors de la dialyse?

A

De cellophane

45
Q

Pour quoi la dialyse est utilisée?

A

Éliminer les sels présents obtenu après précipitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions.

46
Q

Comment fait-on une dialyse?

A

Solution est mise à l’intérieur d’un sac à dialyse, puis immergée dans un large volume de tampon. Après plusieurs heures, les solutions se retrouveront à l’équilibre.

47
Q

Par quoi se définit le principe de chromatographie d’affinité?

A

Un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte.

48
Q

Quelle technique permet de récupérer la protéine désirée sous une forme très pure (en une seule étape)?

A

La chromatographie d’affinité

49
Q

Comment la chromatographie d’affinité réussit à avoir une forme très pure de la protéine en une seule étape?

A

En modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand. Exploite les propriétés biochimiques uniques.

50
Q

Comment exploite-t-on les propriétés biochimiques uniques des protéines?

A

En ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne ou en changeant le pH, la force
ionique et/ou la température.

51
Q

De quoi dépend la quantité de protéine retenue sur la colonne (P-L-M)?

A
  • du Kd’
  • de la concentration de protéine
  • du degré de liaison du ligand à la matrice
52
Q

Comment doit être la matrice pour lier un ligand?

A
  • chimiquement inerte
  • grande porosité
  • nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands
53
Q

Quel matrice est la plus utilisé plus la chromatographie d’affinité?

A

L’agarose.

54
Q

Comment se fait la liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice?

A
  1. réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
  2. le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
55
Q

Que fait-on quand les protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène?

A

Un bras “espaceur” souple est ajouté entre la matrice et le ligand.

56
Q

Pourquoi les protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène?

A

À cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose.

57
Q

Quels sont les moyens de détection des protéines possibles?

A
  • absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre
  • essai colorimétrique
  • essai enzymatique
  • sur gel SDS-PAGE (avec un colorant)
  • avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot)
58
Q

Quels sont les méthodes de détection des protéines non-spécifique?

A
  • absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre
  • essai colorimétrique
59
Q

Quel est la méthode de détection des protéines spécifique?

A

détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot)

60
Q

Comment fonctionne l’essai colorimétrique?

A

contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une couleur mauve à la solution -> l’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration de protéine en solution.

61
Q

Les protéines absorbe la lumière autour de quelle longueur d’onde?

A

280nm

BCM 1521 (6 decks)

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