Isolation des protéines Flashcards
Quel est la première étape dans la purification des protéines?
Les dissoudre dans une phase
liquide.
Quel est la méthode la plus douce et la plus simple?
La lyse osmotique.
Qu’est-ce que la lyse osmotique?
Les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique → différence en concentration = pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule.
V/F La lyse osmotique est plus efficace pour les cellules végétales qu’animales.
Faux.
Que doit-on utiliser pour dégrader les parois cellulaires, des bactéries, levures et végétales?
Les lysozymes.
Nomme moi différentes technique de désintégration mécanique afin de briser les cellules.
- broyage avec du sable, de l’alumine ou des billes de verre de petite taille.
- déchiquetage mécanique (blender de type Waring).
- homogénéisateur (Potter en téflon).
- rupture par haute pression (French press).
- sonication par vibration ultrasonique.
Comment enlève-t-on les particules ou débris cellulaires après la désintégration mécanique?
Par filtration ou centrifugation.
Où se trouve la protéine d’intérêt après la filtration ou centrifugation lors de la solubilisation?
Dans le surnageant.
Qu’est-ce qui différencie les organites dans la méthode de la solubilisation?
Identification par certains marqueurs moléculaires.
Quels sont les trois aspects de la stabilisation des protéines lors de leur purification?
pH, température, protéase.
En quoi le pH stabilise les protéines lors de leur purification?
Solutions tampon qui maintiennent le pH dans une zone “physiologique” (6.5-7.5/8.0) pour éviter d’endommager les protéines.
En quoi la température stabilise les protéines lors de leur purification?
Prot dénaturé par haute température, dénaturent lentement lorsque conservées à 25°C. La purification des protéines à de 0-5°C. Une fois purifiées, peuvent se conserver à long terme à –20 à -80°C.
En quoi les protéases peuvent déstabilise les protéines lors de leur purification?
Les protéases sont libérées lors de la lyse cellulaires et peuvent dégrader les protéines lors de la purification, l’ajout d’inhibiteurs de protéases permet d’empêcher cette dégradation.
Donne moi quatre propriétés physico-chimiques.
Solubilité
Charge ionique
Taille moléculaire
Spécificité
Quelle est la technique associée à la solubilité?
Précipitation
Quels sont les techniques associées à la charge ionique?
Chromatographie par échange d’ions, électrophorèse, focalisation isoélectrique.
Quels sont les techniques associées à la taille moléculaire?
ultracentrifugation, chromatographie par gel-filtration, électrophorèse
Quelle est la technique associée à la spécificité?
chromatographie d’affinité
V/F La distribution des résidus d’acides aminés de types hydrophobe à la surface des protéines est moins importante dans la solubilité des protéines que les résidus de type polaires ou chargés.
Faux, elle est aussi importante.
Quel pourcentage constitut les régions non polaires à la surface d’une protéines globulaire.
50%
La solubilité dépend de trois choses qu’elles sont elles?
a)des interactions polaires avec le solvant aqueux.
b) des interactions ioniques avec les sels en solution.
c) des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire.
Quel est l’impact de la solubilité sur les interactions avec la solution et les protéines?
Augmentent les interactions avec la solution et diminuent les interactions protéines-protéines.
Que crée la précipitation?
La formation d’agrégats de protéines.
Que ce passe-t-il à partir d’une certaine taille d’agrégats?
La force de liaison n’est pas suffisante pour contrecarrer celle de la force gravitationnelle, ce qui mène à la précipitation.
Comment peut-on modifier le solvant pour diminuer la solubilité des protéines?
force ionique (augmentation concentration saline), ajout solvant organique ou de polymère inerte, pH.
En général, la solubilité d’une protéine _ selon la nature des ions en solution et _ avec la concentration de sels en solution.
Varie, augmente
Qu’est ce qui définit le salting in?
Force ionique de zéro à 0.5M, l’augmentation en solubilité avec une concentration croissante en sels.
Comment explique-t-on le phénomène de salting in?
Les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité.
Avec qui interagissent les ions salins?
Avec la protéine
Que font les ions de même charge?
Ils augmentent la répulsion entre protéines, ce qui réduit leur agrégation → favorise leur solubilité.
Que font les ions (hydrophiles)?
augmentent les interactions des protéines avec le solvant aqueux → favorise leur solubilité.
Nomme moi une des techniques les plus utilisées en purification des protéines.
«salting out »
À quoi est dù le «salting out »?
Essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés
et les protéines pour la solvatation.
Quels sont les premières régions à être moins bien solvatées?
Hydrophobes.
En quoi les régions hydrophobes favorise l’agrégation?
Les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau.
Que fait l’hydratation des ions de sels?
Séquestre les molécules d’eau = diminution de la solvatation des protéines.
Que se passe-t-il quand une quantité suffisante de molécules d’eau a été séquestrée?
Les protéines auront moins de surface solvatée, ce qui favorisera leur agrégation.
Quels sont les deux sortes de sels sont utilisés pour la précipitation de protéines?
Chaotropiques et optimaux
Qu’est-ce qu’un sel chaotropiques?
Les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéine peuvent avoir un effet déstabilisant.
Qu’est-ce qu’un sel optimal?
Encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine.
Que nous montre la série de Hofmeister?
La classification des ions favorisants la précipitation vers ceux favorisant la solubilité en ordre.
Quel est le sel le plus couramment utilisé?
Le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4
V/F Au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir moins soluble.
Vrai
Pourquoi au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir moins soluble?
charge globale nette près de zéro minimise la répulsion électrostatique → attirance entre les molécules → agrégation → précipitation isoélectrique.
Quelle est la conséquence de l’addition d’un solvant miscible avec l’eau à un mélange contenant des protéines?
Cela diminue leur solubilité.
Que font les solvants organiques?
Diminuent l’hydratation de surface et augmentent la surface hydrophobe.
V/F La solubilité d’une macromolécule chargée décroît avec la concentration du solvant organique dans la solution. Pourquoi?
Vrai, à cause d’une réduction de la constante diélectrique de la solution.
Nomme un facteur qui détermine la solubilité dans un solvant aqueux/organique.
La taille de la protéine. Plus grande est la protéine, plus basse est la concentration en solvant organique nécessaire afin de la précipiter.
V/F Les protéines plus larges possèdent une surface plus grande, donc une meilleure chance d’avoir une région à la surface chargée qui est complémentaire avec une autre protéine.
Vrai
