Semaine 7

Question 1

Quel est le rôle du SDS?

Answer 1

en se fixant sur les protéines (1.4 mg SDS/mg prot), cause le
dépliement des structures secondaires et tertiaires (brise
les liens non covalents) et leur donne une charge nette
négative proportionnelle à la taille.

Question 2

Le complexe SDS-Protéine migre vers (catode/anode)? à une vitesse inversement proportionnelle au ___

Answer 2

Anode
Log PM

Question 3

Quel est le rôle du b-mercaptoéthanol?

Answer 3

Brise les ponts disulfure entre les résidus Cys

Question 4

Pourquoi place-t-on de l’eau sur le resolving gel?

Answer 4

oxygène interfère avec la polymérisation en captant les radicaux libres

Question 5

Explique le principe du gel de concentration et séparation

Answer 5

• Dans le tampon d’électrophorèse (à pH 8,3) la glycine est chargée négativement (pI = 6,05). La glycine, petite et chargée négativement, entre aussi dans le gel de concentration. Par contre, dès qu’elle entre dans le gel de concentration (pH= 6,8), la glycine n’est presque plus ionisée et migre beaucoup plus lentement que les protéines et les ions Cl- (puisque sa charge nette est ≈ nulle).
• Les protéines (chargées négativement à cause du SDS) sont alors prises entre les deux fronts d’ions.
• Un gradient de haut voltage se créé entre ces deux zones. Ce gradient de voltage provoque l’empilement de toutes les
  protéines en une mince bande. (Les larges pores du « gel de concentration » (4% acrylamide) permettent aux protéines
  d’être plus rapides que les ions glycine mais elles ne se séparent pas les unes des autres).
• Au contact du « gel de séparation » (pH 8,8), les ions glycines redeviennent chargées négativement. Étant plus petites que les protéines elles migrent alors plus rapidement.
• Les protéines poursuivent leur migration vers l’anode mais le % d’acrylamide du gel étant plus élevé cette fois, elles se séparent
  selon leur taille (les petites protéines migrant plus vite).

Question 6

Quel est l’utilité du gel de concentration?

Answer 6

en absence de celui-ci les protéines n’entrerait pas en même temps dans le gel de séparation et formerait des bandes larges et diffuses
Donc permet au protéines d’arriver en même temps au niveau du gel de séparation

Question 7

Selon quoi migrent les protéines sur un gel en conditions non dénaturantes?
avantage?

Answer 7

Selon la charge et la taille
Activité enzymatique peut souvent être démontrée après l’électrophorèse

Question 8

Quel est la différence entre un native gel et un blue native gel?

Answer 8

BNG: bleu de coomassie ajouté avant le dépot sur gel et se lie aux protéines
Les protéines migrent surtout selon la taille
Souvent pour des complexes

Question 9

Est ce que la focalisation isoélectrique sur gel PAGE est dénaturantes ou non dénaturante?
Quelle information donne cette méthode?

Answer 9

non-dénaturante
Connait le pI de la protéine (détermine le pH avec une microélectrode

Question 10

Comment sont séparer les protéines dans une électrophorèse 2D?

Answer 10

1 pI (focalisation)
2 Taille (laemmli

Question 11

Pour quoi est utile le gel Tris-tricine-sds

Answer 11

Surtout pour les prots < 30 kDa

Question 12

Comment fonctionne la technologie «stain-free»?

Answer 12

Le gel de polyacrylamide contient un composé chimique (breveté) qui réagit avec les résidus Trp des protéines pour
engendrer un signal fluorescent spécifique à la localisation des protéines (la réaction de liaison est photoactivable) Après l’électrophorèse, on active le gel quelques minutes (aux UV) puis on prend directement la photo du gel sans avoir à colorer les protéines
Peut aussi servir pour visualiser les protéines présentes sur une membrane après un électrotransfert

Question 13

Quel est l’avantage de l’életrotransfert semi-sec et sec?

Answer 13

plus rapide et utilise moins de tampon

Question 14

Quels sont les avantages et désavantages du SDS et du méthanol pour l’électrotransfert?

Answer 14

SDS : Favorise le transfert des prots vers la membrane mais nuit à leur fixation
Méthanol : Favorise la fixation des protéine en enlevant le SDS mais il nuit au transfert du gel à la membrane

Question 15

Quels sont les types de membranes utilisées, leurs avantages et leurs inconvénient?

Answer 15

Nitrocellulose:
usage polyvalent
fragile (des membranes hybrides existent)
peu sensible à la concentration de SDS
sensible aux solvants organiques
$

Nylon (chargé positivement):
moins fragile que la nitrocellulose
peu utilisé (problèmes de bruit de fond à la révélation)

PVDF (polyvinylidene difluoride):
mécaniquement très résistant
hydrophobe (doit être traitée au méthanol lors du montage)
fixe plus fortement les protéines
plus grande capacité de liaison de protéines par cm2
$$$

Question 16

Pourquoi doit-on bloquer la membrane?

Answer 16

Avant d’ajouter le premier anticorps, on doit saturer les sites de la
membrane avec une protéine inerte pour empêcher la fixation des
anticorps à la membrane

Question 17

Quelle portion de l’anticoprs primaire reconnait l’anticorps secondaire?

Answer 17

Fc

Question 18

Quelle est la différence entre un a.b monoclonal et polyclonal?

Answer 18

mono : reconnait un seul épitope
Poly : population d’anticorps

Question 19

Quels sont les principaux système de détection des anticorps et leur avantages/inconvénient?

Answer 19

Système colorimétrique
le moins sensible (ng)
le plus facile à réaliser
plusieurs substrats disponibles (HRP, AP)

Système chimioluminescent
très sensible (pg - fg)
implique l’utilisation d’une chambre noire (film à rayon-X) ou d’une caméra CCD
plusieurs substrats disponibles (ECL,etc)
permet parfois la quantification du signal obtenu

Système fluorescent
très sensible
requiert des anticorps conjugués à des molécules fluorescentes
implique l’utilisation d’un système d’excitation et de capture d’image

Question 20

Comment fait-on pour valider la linéarité du système de détection employé?

Answer 20

Normalement, le niveau d’expression d’une protéine d’intérêt est comparée au niveau d’expression d’une protéine de référence (ßactin, GAPDH, etc).