semaine 4 Flashcards
Décrire le principe de salting out
Les protéines restent en solution via l’interaction du solvant et de ses portions hydrophiles
L’addition de sel perturbe l’équilibre solvant-protéines solvatées et les molécules d’eau se lient au sel au lieu des protéines. En absence de ces molécules d’eau stabilisantes, les protéines interagissent entres elles et précipitent
Donne les anions et cations en ordre décroissants de leur abilité à faire précipité
anions: PO4>SO4>CH3COO>CL>Br>CLO4>SCN
cations: NH4>Rb>K>Na>Li>Mg>Ca>Ba
Quels sont les avantages à utiliser le sulfate d’ammonium pour le salting out?
À saturation on obtient une forte molarité et une faible densité
Dégage très peu de chaleur lors de sa dissolution
Vrai ou faux
le salting out est une première étape très utile dans un protocole de purification
Vrai
Vrai ou faux
Lors du salting out la qualité de l’extrait et le type de tampon utilisé sont très important
Faux
Quel est le facteur d’enrichissement pour le salting out? son taux de rendement?
3-5
70%
Vrai ou faux
Le culot de protéine créer par salting out est peu stable
Faux très
Quelles sont les conditions de fractionnement?
-[protéines] = 5-30 mg/ml
Faible agitation à 0C
Ajouter sel lentement
Période de repos
Centrifugation à 0C
Culot drainé et dialysé
Vrai ou faux
Souvent une différence de 10% de saturation permet de précipité >90% des prots
Vrai
Nomme un problème d’ajouter le sulfate d’ammonuim sous forme liquide au lieu de solide
augmentation de volume problématique pour les étapes de centrifugation
Vrai ou faux
Une seule méthode de chromatographie est nécessaire pour purifier une prot
Faux, combinaison de méthode
Quels sont les 4 grands types de chromatographie?
-échangeur d’ions
- Tamisage moléculaire
- Hydrophobicité
-Affinité
Quelle propriété des prots aide à déterminer le type d’échangeur à utiliser lors d’une chromato sur colonne échangeuse d’ions?
Le pI
De quoi dépend la force de l’interaction sur un échangeur d’ions?
force ionique et température (+ à basses température et faible force ionique)
Comment les protéines sont élués llors d’une chromato sur échangeur d’ions?
Élués et fractionnées en appliquant un gradient croissant de sel
Comment fonctionne la chromato par tamisage moléculaire?
Selon la taille
Quel information supplémentaire nous donne le tamisage moléculaire?
La taille de la prot
Quel information supplémentaire nous donne le tamisage moléculaire?
La taille de la prot
Si une protéine existe sous forme de monomère ou dimère
Comment fonctionne la chromato par hydrophobicité?
Faire interagir les régions hydrophobes des protéines avec un adsorbant hydrophobe
Vrai ou faux
la température et la force ionique influence la chromato hydrophobicité de manière similaire à la chromato par échange ionique
Faux, de façon contraire
L’élution et le fractionnement des prots lors d’une chromato d’hydrophobicité se fait en appliquant un gradient _____ de sel
décroissant
Comment fonctionne la chromato par affinité?
utilise les interactions spécifiques et réversibles entre une protéine et un ligand
Comment fonctionne la chromato IMAC?
adsorption en présence de faibles concentrations d’imidazole
Élution à fortes concentrations d’imidazole
La chromato IMAC se fait avec des prots natives ou dénaturées?
Les deux
Décrire un protocole typique de purification d’une protéine sur Ni-NTA agarose
-L’échantillon contenant la protéine d’intérêt est ajouté à la résine et mélanger par inversion durant 1h à 4C
-La suspension est placée dans une colonne puis la sédimentation se fait par gravité
-on lave avec des concentration plus grandes d’imidazole
- On élue la protéine d’intérêt avec une haute concentration d’imidazole
-On analyse les différentes fractions sur SDS-PAGE
Quels sont les paramètres à considérer lors de la préparation de colonnes à chromatographie?
-taille de la colonne
-Dépot
-Élution
-Lavage
-Entreposage
