semaine 6

Question 1

Pour quoi est-ce essentiel de mesurer la quantité de protéines présentes dans un échantillon?

Answer 1

Pour déterminer le rendement d’une purification ou l’activité spécifique d’une enzyme

Question 2

Quels sont les critères importants pour le choix de la méthode de dosage?

Answer 2

Quantité et concentration en protéines
Spécificité de l’essai
La présence d’agents chimiques qui peuvent interférer
La facilité à faire l’essai

Question 3

Quels sont les avantages de faire l’absorbance à 280nm?

Answer 3

• Peut se faire directement sur l’échantillon
• relation entre la concentration et l’absorbance est linéaire

Question 4

Quels électrons absorbe le plus à 280nm?

Answer 4

• Max. d’absorp=on par les électrons retrouvés au niveau des résidus aroma=ques (Phe, Trp, His et Tyr).

Question 5

Quels facteurs influencent l’absorbance à 280nm?

Answer 5

• la structure tertiaire (interaction entre certains résidus stabilise les électrons excités)
• Le pH et la force ionique influence la structure tertiaire donc l’absorbance
• Certains produits absorbe aussi (ADN, imidazole, etc)

Question 6

Absorbance 280nm
À quoi équivaut la concentration protéique quand:
-le mélange ne contient pas d’acide nucléique
-Le mélange contient ADN, ARN

Answer 6

• La concentration protéique en mg/ml équivaut à l’absorbance à 280
• la concentration protéique en mg/ml = 1.55Abs280 - 0.76 Abs260

Question 7

Quel est le ratio A280/A260 ou A260/A280 pour une protéine purifiée?

Answer 7

A280/A260 = 2
A260/A280 < 0.6

Question 8

À quoi équivaut le E1% d’une protéine?

Answer 8

à l’absorbance d’une solution 1% de la dite protéine (10mg/ml)

Question 9

Nomme un avantage et un inconvénient de faire l’absorbance à 200-230nm

Answer 9

-Bcp plus sensible qu’à 280
- Bcp d’interférence par les solvants

Question 10

Par quel liens est causée l’absorption à 200-230nm?

Answer 10

liens peptidiques

Question 11

À quoi sert l’absorbance à 200-230nm?

Answer 11

Analyse de peptides ou séparation HPLC-FPLC

Question 12

Pour quoi est utile l’absorbance à 340nm?
Par quoi est causée l’absorption?

Answer 12

Employé pour caractériser une protéine purifiée
Causée par des agrégats (>320nm)

Question 13

Vrai ou faux
la plupart des protéines absorbent à 320nm

Answer 13

Faux,
n’absorbent pas sauf si la protéine est liée à certains groupements prosthétiques

Question 14

Comment savoir s’il n’y a pas d’agrégats avec les mesure d’absorbane à 340nm et 280nm?

Answer 14

A340/(A280-A340)*100 <2

Question 15

Quel est le principe du dosage par la méthode de lowry?
Combien de ug de protéines?

Answer 15

en condition alcaline, le Cu2+ forme un complexeavec les liens peptidiques et devient réduit en Cu+. Le Cu+ainsi que les résidus Tyr, Trp et Cys réagissent avec le réactifde Folin pour donner un composé bleu (650 – 750 nm).
5-100

Question 16

Qu’est ce qui peut affectuer le dosage par la méthode de lowry?

Answer 16

Agent qui peuvent chélater ou réduire et certains détergeants

Question 17

Quelles sont les autres méthodes apparentées au lowry et leurs avantages par rapport à celle-ci?

Answer 17

BCA : stabilité des réactifs et méthodologie simplifiée
Bio-Rad DC : moins sensible au détergeanta, utile pour doser des protéines qui ne peuvent être maintenues en solution qu’en présence de détergents

Question 18

Quelle est le maximum d’absobrance du bleu de coomassie en solution acide?
Alcaline?

Answer 18

595
465

Question 19

Par quoi est stabiliser le bleu de coomassie lorsqu’il est sous forme anionique?

Answer 19

Par les interactions hydrophobe et ionique des protéines

Question 20

Avec quel résidu le bleu de coomassie interagit-il principalement?

Answer 20

Arg

Question 21

Quel composé faut-il ajouté pour doser un échantillon au bleu de coomassie en présence de SDS?

Answer 21

cyclodextrines

Question 22

Pourquoi la courbe standard du dosage de bradford est de type polynomiale?

Answer 22

Parce que le réactif affecte l’absorbance de la solution

Question 23

Quelles sont les méthodes de concentration des protéines?

Answer 23

-Précipitation
-Ultrafiltration
-Lyophilisation
- Dialyse
- Filtration sur gel

Question 24

Quels sont les techniques de précipitation pour concentrer une protéine et leur avantage ou inconvénient?

Answer 24

• Sulfate d’ammonuim : risque faible de dénaturation
  Acétone : risque élevé de dénaturation
• TCA : risque élevé de dénaturation

Question 25

Décrire l’utraflitration

Answer 25

Membrane semi-perméable (MWCO 3 000 à 100 000 Da) à faible
affinité pour les protéines. Le solvant passe au travers des pores
de la membrane par une pression appliquée par centrifugation
ou par une pression gazeuse.

Question 26

Décrire la lyophilisation

Answer 26

Le solvant est évaporé sous vide (état solide à gaz).
Il y a concentration des sels présents dans le solvant.
Certains solvants sont volatils (e.g. ammonium carbonate)

Question 27

Décrire la dialyse

Answer 27

Diffusion du solvant au travers des pores d’une membrane semiperméable (influencé par plusieurs paramètres dont la
concentration, le volume, la température et la taille).

Question 28

Décrire la filtration sur gel

Answer 28

Les protéines (conditions natives) sont exclues des pores du gel
et sont éluées dans le volume mort de la colonne (dessalage).

Question 29

Quelles méthodes sont utilisées pour quantifier la pureté?

Answer 29

-SDS-PAGE
- Chromatographie (RP-HPLC)