semaine 6 Flashcards
Pour quoi est-ce essentiel de mesurer la quantité de protéines présentes dans un échantillon?
Pour déterminer le rendement d’une purification ou l’activité spécifique d’une enzyme
Quels sont les critères importants pour le choix de la méthode de dosage?
Quantité et concentration en protéines
Spécificité de l’essai
La présence d’agents chimiques qui peuvent interférer
La facilité à faire l’essai
Quels sont les avantages de faire l’absorbance à 280nm?
- Peut se faire directement sur l’échantillon
- relation entre la concentration et l’absorbance est linéaire
Quels électrons absorbe le plus à 280nm?
- Max. d’absorp=on par les électrons retrouvés au niveau des résidus aroma=ques (Phe, Trp, His et Tyr).
Quels facteurs influencent l’absorbance à 280nm?
- la structure tertiaire (interaction entre certains résidus stabilise les électrons excités)
- Le pH et la force ionique influence la structure tertiaire donc l’absorbance
- Certains produits absorbe aussi (ADN, imidazole, etc)
Absorbance 280nm
À quoi équivaut la concentration protéique quand:
-le mélange ne contient pas d’acide nucléique
-Le mélange contient ADN, ARN
- La concentration protéique en mg/ml équivaut à l’absorbance à 280
- la concentration protéique en mg/ml = 1.55Abs280 - 0.76 Abs260
Quel est le ratio A280/A260 ou A260/A280 pour une protéine purifiée?
A280/A260 = 2
A260/A280 < 0.6
À quoi équivaut le E1% d’une protéine?
à l’absorbance d’une solution 1% de la dite protéine (10mg/ml)
Nomme un avantage et un inconvénient de faire l’absorbance à 200-230nm
-Bcp plus sensible qu’à 280
- Bcp d’interférence par les solvants
Par quel liens est causée l’absorption à 200-230nm?
liens peptidiques
À quoi sert l’absorbance à 200-230nm?
Analyse de peptides ou séparation HPLC-FPLC
Pour quoi est utile l’absorbance à 340nm?
Par quoi est causée l’absorption?
Employé pour caractériser une protéine purifiée
Causée par des agrégats (>320nm)
Vrai ou faux
la plupart des protéines absorbent à 320nm
Faux,
n’absorbent pas sauf si la protéine est liée à certains groupements prosthétiques
Comment savoir s’il n’y a pas d’agrégats avec les mesure d’absorbane à 340nm et 280nm?
A340/(A280-A340)*100 <2
Quel est le principe du dosage par la méthode de lowry?
Combien de ug de protéines?
en condition alcaline, le Cu2+ forme un complexeavec les liens peptidiques et devient réduit en Cu+. Le Cu+ainsi que les résidus Tyr, Trp et Cys réagissent avec le réactifde Folin pour donner un composé bleu (650 – 750 nm).
5-100
Qu’est ce qui peut affectuer le dosage par la méthode de lowry?
Agent qui peuvent chélater ou réduire et certains détergeants
Quelles sont les autres méthodes apparentées au lowry et leurs avantages par rapport à celle-ci?
BCA : stabilité des réactifs et méthodologie simplifiée
Bio-Rad DC : moins sensible au détergeanta, utile pour doser des protéines qui ne peuvent être maintenues en solution qu’en présence de détergents
Quelle est le maximum d’absobrance du bleu de coomassie en solution acide?
Alcaline?
595
465
Par quoi est stabiliser le bleu de coomassie lorsqu’il est sous forme anionique?
Par les interactions hydrophobe et ionique des protéines
Avec quel résidu le bleu de coomassie interagit-il principalement?
Arg
Quel composé faut-il ajouté pour doser un échantillon au bleu de coomassie en présence de SDS?
cyclodextrines
Pourquoi la courbe standard du dosage de bradford est de type polynomiale?
Parce que le réactif affecte l’absorbance de la solution
Quelles sont les méthodes de concentration des protéines?
-Précipitation
-Ultrafiltration
-Lyophilisation
- Dialyse
- Filtration sur gel
Quels sont les techniques de précipitation pour concentrer une protéine et leur avantage ou inconvénient?
- Sulfate d’ammonuim : risque faible de dénaturation
Acétone : risque élevé de dénaturation - TCA : risque élevé de dénaturation
