Semaine 2

Question 1

Vrai ou faux
E. coli est l’organisme le plus utilisé pour l’obtention de structures de protéine

Answer 1

Vrai

Question 2

Quels sont les trois localisation possible des protéines lors de l’expression hétérologue chez E. coli?
Quelle est la plus fréquente?

Answer 2

dans le cytoplasme -> plus fréquent
Dans l’espace périplasmique
Sécrétée dans le milieu

Question 3

Quels sont les avantages/ inconvénient de faire l’expression de protéines localisée dans le cytoplasme?

Answer 3

• Haut rendement
  -Parfois formation de corps d’inclusion
• Milieu réducteur (pont disulfure)

Question 4

Quels sont les avantages/inconvénient de faire l’expression de protéines localisées dans l’espace périplasmique?

Answer 4

• Purification simplifiée
  -Facilite la formation de ponts disulfure
  -Besion d’un signal peptidique en N-terminal
  -Environnement riche en protéases

Question 5

Quels sont les avantages/inconvénient de faire l’expression de protéines sécrétées dans le milieu?

Answer 5

-Purification simplifiée (parfois)

Question 6

Quand est-ce que les ponts disulfure sont habituellement formés?

Answer 6

lorsque les protéines sont sécrétées ou dirigées vers la membrane externe

Question 7

Ou se fait la formation de ponts disulfure chez les eucaryote? Chez les procaryotes?

Answer 7

Mitochondrie et RE chez eucaryote et espace périplasmique chez les procaryotes

Question 8

Quels sont les caractéristiques principales des souches d’expression disponibles?

Answer 8

• Souches souvent déficiente en certaines protéases
• Souche doit posséder les éléments essentiels au système d’expression
• Certaines ont d’autres propriétés particulières

Question 9

quel est le principal rôle des souches de clonage?

Answer 9

Vise à améliorer la croissance, la transformation, la stabilité et la qualité de l’ADN isolé

Question 10

Quel système d’expression est le plus fréquenment employé?

Answer 10

pET

Question 11

Décrire le protocole typique de surexpression d’une protéine hétérologue chez E. coli

Answer 11

-Pré-culture d’une nuit à 37C en LB+ antibio
- Culture en LB à 37 jusqu’à D.O600 d’environ 0.6 avec bonne aération
- Transfert à 20C
- Induction par ajout d’IPTG à 1mM final
-Récolte des cellules après 16h de croissance
-Congélation des cellules pour analyse/purification

Question 12

Comment est-il possible d’optimiser les conditions de culture?

Answer 12

• Culture en batch ou en fermentateur
• Milieu avec ou sans glucose
• Température (prots plus soluble en abaissant la T juste avant l’inducation
• milieu intélligent

Question 13

Comment est-il possible d’optimiser l’induction?

Answer 13

-Moment (D.O)
- Durée et T
-Concentration de l’inducteur

Question 14

comment est-il possible d’optimiser le système employé?

Answer 14

-Promoteur
-Usage codon
- Co-expression avec des protéines chaperonnes (solubilité)
- Fusion à un TAG (solubilité)

Question 15

Comment peut-on faire l’étude de la solubilité de la protéine surexprimé?

Answer 15

-Lyse des celulles
-Centrifugation
-Fraction soluble et insoluble sur SDS-PAGE

Question 16

Pourquoi faut-il des protéines solubles?

Answer 16

-Procédés de purification nécessitent des protéines soluble
-Les buts poursuivis impliquent générallement l’obtention d’une protéine soluble
- l’activité biologique est généralement associée à une protéine soluble

Question 17

Pourquoi une protéine serait insoluble?

Answer 17

-Solubilité diminue au pI d’une protéine
-Certaines protéines sont naturellement peu soluble
- Protéine normalement soluble mais qui n’a pas sa conformation native normale

Question 18

Vrai ou faux
Beacoup de protéines chez S. cerevisiae ont un pI entre 7.3 et 7.4

Answer 18

Faux très peu

Question 19

Qu’est ce qu’un corps d’inclusion?

Answer 19

Agrégats de protéines insoluble, généralement cytoplasmique
Souvent engendré par des conditions d’expressions déréglées par rapport à l’hote naturel
Peut représenter près du tiers des protéines totales de la cellule
Composition très homogène et de haute densité

Question 20

Quelle est la méthode conventionnelle pour la solubilisation des corps d’inclusion et leur retour à la forme native?

Answer 20

-Lyse des cellules et lavage avec du détergent pour éliminer les contaminants majeurs
-Solubilisation en présence de haute concentrations d’agents dénaturants, chaotropique et d’agents réducteurs
- Retour à la forme native et oxidation des ponts disulfure
-Puriication et caractérisation des protéines solubles

Question 21

Quelle est la méthode alternative pour solubiliser les corps d’inclusion?

Answer 21

solubilisation en présence de solvants organiques ou faibles concentrations d’agents dénaturants et tampon de pH alcalins

Question 22

Quelle est la différence entre la méthode conventionnelle et alternative pour solubiliser les corps d’inclusion?

Answer 22

conventionnelle : solubilisation efficace, retour à la forme native difficile
alternative : contraire

Question 23

Quelles sont d’autres alternatives quand la protéine est exprimé de manière insoluble?

Answer 23

• enlever une ou des partie du gène codant pour la protéine dans le but d’obtenir une protéine tronquée mais soluble
  -Mutagénèse dirigée -> modifier les propriété problématique d’un ou quelques a.a
  -Fusion avec NT*-TAG