Semaine 2 Flashcards
Vrai ou faux
E. coli est l’organisme le plus utilisé pour l’obtention de structures de protéine
Vrai
Quels sont les trois localisation possible des protéines lors de l’expression hétérologue chez E. coli?
Quelle est la plus fréquente?
dans le cytoplasme -> plus fréquent
Dans l’espace périplasmique
Sécrétée dans le milieu
Quels sont les avantages/ inconvénient de faire l’expression de protéines localisée dans le cytoplasme?
- Haut rendement
-Parfois formation de corps d’inclusion - Milieu réducteur (pont disulfure)
Quels sont les avantages/inconvénient de faire l’expression de protéines localisées dans l’espace périplasmique?
- Purification simplifiée
-Facilite la formation de ponts disulfure
-Besion d’un signal peptidique en N-terminal
-Environnement riche en protéases
Quels sont les avantages/inconvénient de faire l’expression de protéines sécrétées dans le milieu?
-Purification simplifiée (parfois)
Quand est-ce que les ponts disulfure sont habituellement formés?
lorsque les protéines sont sécrétées ou dirigées vers la membrane externe
Ou se fait la formation de ponts disulfure chez les eucaryote? Chez les procaryotes?
Mitochondrie et RE chez eucaryote et espace périplasmique chez les procaryotes
Quels sont les caractéristiques principales des souches d’expression disponibles?
- Souches souvent déficiente en certaines protéases
- Souche doit posséder les éléments essentiels au système d’expression
- Certaines ont d’autres propriétés particulières
quel est le principal rôle des souches de clonage?
Vise à améliorer la croissance, la transformation, la stabilité et la qualité de l’ADN isolé
Quel système d’expression est le plus fréquenment employé?
pET
Décrire le protocole typique de surexpression d’une protéine hétérologue chez E. coli
-Pré-culture d’une nuit à 37C en LB+ antibio
- Culture en LB à 37 jusqu’à D.O600 d’environ 0.6 avec bonne aération
- Transfert à 20C
- Induction par ajout d’IPTG à 1mM final
-Récolte des cellules après 16h de croissance
-Congélation des cellules pour analyse/purification
Comment est-il possible d’optimiser les conditions de culture?
- Culture en batch ou en fermentateur
- Milieu avec ou sans glucose
- Température (prots plus soluble en abaissant la T juste avant l’inducation
- milieu intélligent
Comment est-il possible d’optimiser l’induction?
-Moment (D.O)
- Durée et T
-Concentration de l’inducteur
comment est-il possible d’optimiser le système employé?
-Promoteur
-Usage codon
- Co-expression avec des protéines chaperonnes (solubilité)
- Fusion à un TAG (solubilité)
Comment peut-on faire l’étude de la solubilité de la protéine surexprimé?
-Lyse des celulles
-Centrifugation
-Fraction soluble et insoluble sur SDS-PAGE
Pourquoi faut-il des protéines solubles?
-Procédés de purification nécessitent des protéines soluble
-Les buts poursuivis impliquent générallement l’obtention d’une protéine soluble
- l’activité biologique est généralement associée à une protéine soluble
Pourquoi une protéine serait insoluble?
-Solubilité diminue au pI d’une protéine
-Certaines protéines sont naturellement peu soluble
- Protéine normalement soluble mais qui n’a pas sa conformation native normale
Vrai ou faux
Beacoup de protéines chez S. cerevisiae ont un pI entre 7.3 et 7.4
Faux très peu
Qu’est ce qu’un corps d’inclusion?
Agrégats de protéines insoluble, généralement cytoplasmique
Souvent engendré par des conditions d’expressions déréglées par rapport à l’hote naturel
Peut représenter près du tiers des protéines totales de la cellule
Composition très homogène et de haute densité
Quelle est la méthode conventionnelle pour la solubilisation des corps d’inclusion et leur retour à la forme native?
-Lyse des cellules et lavage avec du détergent pour éliminer les contaminants majeurs
-Solubilisation en présence de haute concentrations d’agents dénaturants, chaotropique et d’agents réducteurs
- Retour à la forme native et oxidation des ponts disulfure
-Puriication et caractérisation des protéines solubles
Quelle est la méthode alternative pour solubiliser les corps d’inclusion?
solubilisation en présence de solvants organiques ou faibles concentrations d’agents dénaturants et tampon de pH alcalins
Quelle est la différence entre la méthode conventionnelle et alternative pour solubiliser les corps d’inclusion?
conventionnelle : solubilisation efficace, retour à la forme native difficile
alternative : contraire
Quelles sont d’autres alternatives quand la protéine est exprimé de manière insoluble?
- enlever une ou des partie du gène codant pour la protéine dans le but d’obtenir une protéine tronquée mais soluble
-Mutagénèse dirigée -> modifier les propriété problématique d’un ou quelques a.a
-Fusion avec NT*-TAG
