semaine 3 Flashcards
Lors de quelles étapes l’intégrité de la protéine peut être perdue?
lors du bris cellulaire ou lors des étapes subséquente de purification
Quelles sont les causes de la perte de l’activité d’une enzyme?
- Modifications de la protéines (protéolyse, purification, etc)
- Phénomène physique (liaison aux surfaces, précipitation)
Vrai ou faux
On devrait d’abord identifier les principaux paramètres qui affectent la stabilité de la protéine que l’on veut purifier
Vrai
Comment peut on prévenir la perte d’activité d’une protéine en controlant le pH?
- Regarder l’influence de la température et de la force ionique sur le tampon
- Capacité du tampon
- interaction possible du tampon avec certains ion étalliques
- Compatibilité du tampon avec les étapes subséquentes de purification
Comment peut-on choisir le bon pH?
Faire une étude de stabilité à différents pH
Comment peut-on controler la température pour prévenir la perte d’activité de la protéine?
- Lors du bris cellulaire la température peut augmenter
- Toujours refroidir les solutions et l’appareillage
Comment peut-on faire pour prévenir la perte d’activité des protéines à cause de la protéolyse?
- ajouter des inhibiteurs de protéases
Comment est-il possible de protéger les groupements thiols contre l’oxydation et les métaux lourds?
- inclure du b-mercaptoéthanol ou du dithiothréitol
- Inclure de l’EDTA pour chélater les ions metalliques
Que peut-il arriver si une solution est mélangée vigoureusement?
dénaturation par oxydation
Comment est-il possible de protéger les protéines contre les radicaux libres?
Inclure des sucres réducteurs comme le glucose
Vrai ou faux
Le stress de congélation peut affecter l’activité d’une protéine
Vrai
Vrai ou faux
Il est mieux de garder les protéines dans des solutions diluées.
Expliquer
Faux
plusieurs protéines vont vont perdre leur activité lorsqu’elles sont diluées ou vont adhérer aux parois de verre.
Concentrer, ajouter une protéine inerte comme le BSA ajouter du glycérol
Vrai ou faux la lyse enzymatique des cellules est souvent effectuée en présence d’un détergent ionique
Faux, non-ionique
Quelles sont les avantages et les désavantages de la lyse des cellules par procédé enzymatique?
Avantages :
- Minimise la dénaturation
- Indépendant de la quantité
-Permet une certaine sélectivité dans le relachement des produits cellulaires
Désavantages :
-Beaucoup de variables à tester
- Surtout pour des petits volumes et plusieurs échantillons
- Efficacité moindre donc parfois couplé à une méthode mécanique
$$
Quelle est la procédure enzymatique pour les bactérie à gram -
Utilisation du tris et de EDTA pour relacher les LPS et perméabiliser la membrane externe
digestion de la paroi avec lysozyme
cycle gel/dégel
Choc osmotique
utilisation d’un détergent non ionique
Selon quoi sont généralement classés les détergents
Leur groupement hydrophile
Est ce que ses détergents sont fortement ou faiblement dénaturant? donne un exemple pour chaque
-Anionique
- Cationiques
-non ioniques
-amphotères
- fortement - SDS
- Fortement - CTAB
- Faiblement - triton x-100
-Faiblement - CHAPS
Quelles sont les avantages et désavantages de la lyse des cellules par procédé mécanique?
Avantages:
- Pas d’ajout d’agent chimique
indépendant de l’espèce
- Économique à l’emploi
Désavantages:
-force mécanique se traduit en chaleur
- Peut provoquer la formation de broue (oxydation)
- Relachement de l’ADN chromosomique
Quels facteursinfluencent l’efficacité lors de la lyse des cellules par agitation avec des billes de verre ou de zirconium?
-concentration des cellules
- Vitesse d’agitation
- Durée d’agitation
-Concentration des billes
- Diamètre des billes
Quels facteurs influence la lyse des cellules par agitation avec un abrasif?
-opérateur
-pénible
-petits échantillons seulement
- Plus douce des méthodes mécanique s
Comment fonctionne la presse de French?
Passage rapide d’une très forte pression à la pression atmosphérique fait éclater les cellules
Vrai ou faux
La lyse des cellules par presse de French est peu efficace
Faux
Quel est le désavantage de la presse de French?
Appareil fragile lourd et encombrant
Quels sont les avantages de l’emulsiflex par rapport à la presse de French?
Peu de pièce mobile
moins fragile
Simple et efficace
Qu’est ce que la sonication?
Bris des cellules généré par des pulses intenses d’ultra-sons
Quels sont les avantages et inconvénients de la sonication
- brise l’ADN en petit fragments
-Efficace pour de petits volumes surtout
-rechauffe l’échantillon rapidement
