secuenciación Flashcards
¿Qué es la secuenciación?
Serie de procesos bioquímicos que determinarán el orden de las bases nitrogenadas en una cadena de ADN
Primer método de secuenciación basado en radioactividad y que utiliza colorimetría donde se adhieren dDNTP’s y la replicaciónde ADN con ayuda de la DNA po
Sanger
¿Qué puede hacer el método de secuenciación de Sanger?
Puede terminar la cadena de manera aleatoria
¿Cómo se hace la amplificación en la metodología de Sanger?
Con ayuda de la DNA polimerasa
¿Cuántos fragmentos se pueden leer en la metodología de Sanger?
50-300 nucleotidos
Son nucleotidos específicos que permiten que la cadena se pueda cortar en fragmentos de diferentes tamaños
Next generation sequency
Posterior a la secuenciación de Sanger que permite secuenciar de manera masiva
¿Cuáles son algunos de los métodos de next generation sequency?
-pirofosfatos (roche)
-ilumina: SOLEXA
-por emulsión: ion torrent
Ilumina: solexa
Se basa en la amplificación en puente o en cluster
Técnica que no usa gel de acrilamida
Pirofosfatos
Roche
Cuando se añade un nucleotido a la cadena de ADN,se libera un pirofosfato
Método que no usa colorimetría
PCR,su amplificación es igual a la de pirosecuenciacion
¿Qué utiliza ion torrent si no utiliza colorimetría?
Voltaje y pH, cuando se añade un nucleotido cambia el pH y cambia el voltaje
Cobertura
La cantidad promedio de lecturas que se han alineado a una secuencia de referencia
Profundidad
Las veces que has secuenciado el fragmento
¿Qué significa que haya más profundidad?
Mientras más veces has corroborado la secuencia, tienes ,mas control de calidad de que la secuencia es correcta
Preparación de muestras para la secuenciación
Fragmentación
Librerías
Análisis bioinformático
Fragmentación
-cortar ADN en fragmentos más pequeños
-métodos mecánicos
-métodos enzimaticos
Ligadura a 1 adaptador más específico
Segmentos de DNA modificados y se adicionan insertos para que cada muestra pueda ser identificada
Librerías
¿Qué permiten la librerías?
La secuenciación de múltiples muestras
Análisis bioinformático
Base calling
Read allingment
Variant identification
Variant anotation
Base calling
Identificación de nucleotidos y van a ir llegando y pegándose
¿Cómo identificamos variaciones o mutaciones?
Secuencia obtenida es alineada con otra de referencia
Validación de la corrida
Se evalúa:
-sensibilidad analítica
-límite de detección -especificidad analítica
-exactitud
-precisión
-cobertura y profundidad
Sensibilidad analítica
Refleja el % de muestras positivas
Límite de detección
Menor frecuencia de variantes
Si encuentras menor frecuencia, lo estás haciendo bien
