Section 2.1, 2.2 et 2.3 Flashcards
La chimie de la synthèse d’ADN
Quels sont les substrats essentiels afin de procéder à la synthèse de l’ADN?
- Les 4 désoxynucléoside triphosphates : dGTP, dCTP, dATP, dTTP
- Jonction primer:template : arrangement particulier d’ADN simple-brin et d’ADN double-brin.
* Template étant l’ADN simple-brin qui dirige l’addition de chaque désoxynuclétoides complémentaires (donne seulement l’information nécessaire)
* Primer étant complémentaire au template, et ayant un 3’-OH exposé qui s’allonge lors de l’addition du nucléotide.
La chimie de la synthèse d’ADN
Comment la chaîne de l’ADN est-elle allongée (réaction permettant de former le lien phosphodiester du nouveau nucléotide)?
L’extrémité 3’-OH du primer est étendue pendant l’addition d’un nucléotide : le lien phosphodiester est formé par une attaque d’OH au groupe alpha-phosphoryl du nucléoside triphosphate (libération du pyrophosphate).
La chimie de la synthèse d’ADN
Quel est le rôle du template lors de l’addition d’un nucléotide?
Le template sert à diriger quel nucléoside triphosphate est ajouté. Le nucléoside triphosphate qui se paire avec le template (qui est en sens inverse, et qui contient donc la base complémentaire) est favorisé lors de l’addition avec le primer.
La chimie de la synthèse d’ADN
Quelle est la force permettant la polymérisation des nucléotides en ARN?
Couplage des réactions de l’extension de la chaine + l’hydrolyse rapide du pyrophosphate relâché par la pyrophosphatase
Avec ces deux réactions couplée, la réaction devient très favorable (delta G de -7 kcal/mol) est irréversible.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Par quelles enzymes est catalysée la synthèse d’ADN?
Par les ADN-polymérases
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Vrai ou faux? Les ADN-polymérases peuvent catalyser 4 réactions dans leur site actif (contrairement à la plupart des enzymes qui ne peuvent en catalyser qu’une seule)
Vrai, les 4 réactions d’addition des nucléosides triphosphates.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Comment l’ADN polymérase fait-il pour effectuer le bon pairage entre les bases?
L’ADN polymérase regarde l’abilité du prochain nucléotide à former une paire A:T ou G:C (ne détecte donc pas le nucléotide exact qui entre dans son site actif)
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Qu’arrive-t-il lorsque la base est incorrectement pairée par l’ADN polymérase?
La vitesse d’addition des nucléotides est grandement diminuée (environ 10 000x plus lente) à cause de l’alignement non favorable de ces substrats.
Il s’agit d’un example de “kinetic proofreading”, dans lequel l’enzyme permet d’accélèrer la vitesse de formation des liens seulement lorsque le bon substrat est présent.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Comment les ADN polymérases sont-ils en mesures de distinguer les ribonucléosides (rNTP) des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP)?
Par exclusion stérique des rNTP du site actif : les ADN polymérase ne sont pas en mesure d’accomoder un 2’-OH de nucléotide entrant, car l’espace est occupé par deux acides aminés de discrimination qui font contact avec le cycle du sucre présent
Le mécanisme de l’ADN polymérase
À quoi ressemble la structure atomique des ADN polymerase?
À une main qui aggripe le primer.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Comment se nomment les trois domaines des ADN polymérase?
Suivant l’analogie de la main, il s’agit du pouce, des doigts et de la paume.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
De quoi est composé le domaine de la paume des ADN polymérases?
D’une feuille beta, et de deux ions (générallement Mg2+ ou Zn2+) qui permettent d’altérer l’environnement chimique autour des dNTP correctement pairés et l’extrémité 3’OH du primer.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Expliquez le mécanisme réactionnel des deux ions présent dans le domaine de la paume de ADN polymérases.
Le premier ion réduit l’affinité du 3’-OH pour son hydrogène. Cela génère un 3’-O- qui est primé pour l’Attaque nucléophile du alpha-phosphate du prochain NTP
Le deuxième ion coordine les charges négatives du beta-phosphate et du gamma-phosphate du dNTP et stabilise le pyrophosphate en rejoignant le primer et le nucléotide entrant.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Quel autre rôle que la catalyse du pairage joue le domaine de la paume des ADN polymérase?
Il observe le pairage des derniers nucléotides ajoutés à partir de liens hydrogènes (non spécifiques aux bases) avec les paires de bases du sillon mineur du nouvel ADN, qui se forment seulement si les deux nucléotides sont correctement pairés.
Si l’ADN est mal pairé, la catalyse est dramatiquement ralentie.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Quel rôle joue le domaine des doigts des ADN polymérases?
Il accélère la catalyse : des résidus se trouvent dans le domaine des doigts, et lorsqu’un dNTP entrant correspond au bon pairage, le domaine se déplace afin d’enfermer le dNTP et permet ainsi un contact avec les ions métalliques de la paume.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Que rôle joue le domaine du pouce?
N’agit pas sur la catalyse : ce domaine intéragit avec l’ADN synthétisé pour :
* Maintenir la bonne position du site actif et du primer
* Aider à maintenir une forte associaiton entre l’ADN polymérase et son substrat (qui contribue à l’abité de l’ADN polymérase d’ajouter des dNTP chaque fois qu’ils lie un primer:template.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Expliquez la série d’évènement complète menant à l’addition d’un nucléotide au primer.
- Le nucléotide entrant se paire avec la prochaine base du template
- Les doigts se referment autour du dNTP
- Le dNTP est en contact avec les ions qui catalysent la formation du lien phosphodiester
- Les doigts se réouvrent et la jonction primer:template se déplace d’une paire.
- Le cycle recommence et est fortement stimulée par un paraige correct entre le dNTP et le template.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Combien de nucléotides sont ajoutés à un primer par seconde?
Environ 1000 nucléotides par secondes! (C’est rapide)
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Pourquoi la synthèse de l’ADN est-elle si rapide?
À cause de la nature processive de l’ADN polymérase : charactérstique des enzymes qui opèrent sur des substrats polymériques.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Qu’est-ce que le degré de processivité d’un ADN polymérase?
Le nombre moyen de nucléotides ajoutés chaque fois que l’Enzyme lie une jonction primer:template (allant de quellques nucléotides à plus de 50 000 nucléotides)
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Quelle est l’étape limitante du taux de synthèse d’ADN?
La liaison initiale de la polymérase à la jonction primer:template (1 seconde pour trouver et se lier, vs addition des nucléotides dans les millisecondes)
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Comment la processivité de l’ADN est-elle facilitée?
Par glissement de l’ADN polymérase sur le template grâce à des force électrostatiques entre le squelette phosphate et le domaine du pouce, et des intéractions entre le sillon mineur et le domaine de la paume.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Vrai ou faux? Le système basé seulement sur la géometrie des paires de bases et leur complémentarité est suffisant pour avoir une synthèse d’ADN aussi précise.
Faux, il existe des ‘exonucléase de “proofreading”’ qui permettent d’améliorer la précision.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Nommez un des problèmes qui pourrait arriver et nuire à la synthèse d’ADN (et justifie le système de proofreading).
Les bases changent parfois de conformation tautomérique (imino ou enol), ce qui crée des paires de bases incorrectes.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Comment les exonucléases de proofreading sont-elles en mesures de régler le problème de changement de conformation des bases?
- Les exonucléases de proofreading dégradent l’ADN à partir de l’extrémité 3’ mais ont une préférence accrue pour l’ADN ayant des paires de bases incorectes.
- Cette dégradation est facilité par l’abilité de l’ADN polymrase d’ajouter un nucléotide adjacent à un primer incorrectement lié. (Réduction effectuée de la même manière qu’un dNTP mal pairé).
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Quelle est la différence entre un exonucléase et un endonucléase?
Les exonucléase dégradent l’ADN à partir des extrémités, les endonucléase peuvent dégrader à l’intérieur de l’ADN.
Le mécanisme de l’ADN polymérase
Vrai ou faux? Les exonucléases peuvent seulement éliminer les erreurs les plus récentes.
Vrai, si une erreur passe inaperçue par l’exonucléase elle sera dégradée plus tard mais pas par l’exonucléase
(processus de réparation postréplication).
La fourche de réplication
Par quelle étape la synthèse d’ADN doit elle passer avant la formation de la jonction primer:template?
La séparation des deux brins d’un ADN double brins qui servent tous deux de template en parallèle : la fourche de réplaication
La fourche de réplication
Nommez une complication de la réplication simultanée
Les brins sont anti-parallèles : seulement un des deux ADN polymérase est en mesure de suivre la séparation d’ADN facilement.
La fourche de réplication
Comment appelle-t-on le brin d’ADN directement répliqué par l’ADN polymérase?
“Leading strand” ou brin meneur??
La fourche de réplication
Comment appelle-t-on le brin d’ADN où l’ADN polymérase se déplace dans la direction opposée?
“Lagging strand” ou brin retardé.
La fourche de réplication
Comment fonctionne la synthèse d’ADN à partir du brin retardé?
- Il faut que le brin ait avancé d’une longueur substentielle pour être répliqué
- Une fois que cette longueur est substantielle, la synthèse est initiée et continue jusqu’à l’atteinte de l’extrémité 5’ du dernier segment d’ADN synthétisé.
- Les fragments d’ADN formé de cette manière sont ensuite joint ensemble de manière covalente pour former un brin d’ADN continu.
La fourche de réplication
Comment sont appelés les fragments d’ADN synthétisé dans le brin retardé de la fourche de réplication?
Les fragments d’Okazaki, qui sont des intermédiaires transient de la réplication de l’ADN.
La fourche de réplication
Vrai ou faux? L’ADN polymérase peut commencer la synthèse d’ADN sans primer.
Faux, le primer est essentiel au bon fonctionnement de l’ADN polymérase.
La fourche de réplication
Comment le primer est-il formé?
Par la Primase, une ARN polymérase, qui peut former un brin d’ARN très court (5-10 nucléotides) servant de primer à l’ADN polymérase.
La fourche de réplication
Combien de primase est nécessaire pour le brin meneur et le brin retardé?
Pour le brin meneur, une seule primase est nécessaire parce qu’un seul primer peut générer un brin complet d’ADN.
Pour le brin retardé, chacun des fragments d’okazaki doivent avoir chacun leur primer respectif (activité de la primase beaucoup plus élevée/plusieurs primase)
La fourche de réplication
De quoi a besoin la primase pour initier la synthèse d’ARN?
À partir d’un template d’ADN simple brin avec un “trimer” particulier (E.coli = GTA)
La fourche de réplication
Comment l’activité de la primase peut-elle être drastiquement augmentée?
Par son association avec une autre protéine agissant à la fourche de réplication : L’ADN hélicase.
La fourche de réplication
Quel est le rôle de l’ADN hélicase?
Dénouer l’ADN à la fourche de réplication, ce qui crée un template d’ADN simple brin sur laquelle la primase peut agir (cela assure que la primase est seulement active à la fourche de réplication).
La fourche de réplication
Quelle étape est nécessaire à la completion de la réplication d’ADN?
Le retrait du primer ARN et son remplacement par l’ADN (mécanisme qui ressemble fortement à la réparation d’ADN)
La fourche de réplication
Quelle est l’enzyme responsable de remplacer le primer d’ARN avec de l’ADN?
La RNase H qui reconnait et supprime la plupart des primer d’ARN.
La fourche de réplication
Expliquez le mécanisme de la RNase H.
- La RNase H reconnait l’ARN lié à l’ADN et enlève le primer sauf le ribonucléotide directement lié à l’extrémité d’ADN (car la RNase H peut seulement cliver les lien entre deux ribonucléotides).
- Le ribonucléotide final est enlevé par un exonucléase 5’.
- L’ADN polymérase remplit la marge laissée jusqu’à ce que chaque nucléotide soit pairé, et une enzyme (ADN ligase) vient créer un lien entre le 5’-phospphate et le 3’-OH.
La fourche de réplication
Comment les ADN hélicases se déplacent-ils sur l’ADN simple brin (pour dénouer l’ADN)?
À partir de l’énergie de liaison et de l’hydrolyse des nucléoside triphosphate (généralement l’ATP), l’ADN hélicase déplace l’ADN qui est lié à l’ADN simple brin sur lequelle il est placé.
La fourche de réplication
Quelle est la forme de l’ADN hélicase et comment cette forme lui permet-elle de bien effectuer sa fonction?
Il s’agit de protéine hexamériques sous forme d’anneau, qui encercle un des deux brins à la fourche de réplication.
La forme d’anneau permet d’entourer l’ADN et donc doit être ouvert pour laisser sortir l’ADN de sont site actif, ce qui est très rare.
À l’extrémité de l’ADN, l’ADN hélicase est libérée car il n’y a plus d’ADN à l’intérieur.
La fourche de réplication
Quel est le problème de l’ADN hélicase lors de sa liaison avec un ADN?
Indice : ce problème est surtout problématique pour les ADN circulaires.
Comme la forme de l’hélicase est en anneau, il faut une extrémité pour se lier au substrat d’ADN naturellement (les ADN circulaires n’ont pas d’extrémité, donc un mécanisme d’ouverture de l’hélicase est présent).
La fourche de réplication
Comment l’ADN hélicase se lie-t-il à un brin d’ADN?
Un mécanisme spécialisé permet d’ouvrir l’anneau de l’ADN hélicase et le placer autour de l’ADN avant la reformation de l’aneau.
La fourche de réplication
Qu’est-ce que la propriété de polarité de l’ADN hélicase?
La polarité est soit de 5’ à 3’ ou 3’ à 5’ : c’est la direction définie de mouvement de l’ADN hélicase.
Le brin définie la polarité de l’ADN hélicase, qui veut toujours aller dans la direction de la fourche de réplication.
Lorsqu’une enzyme tente de se déplacer dans une direction définie, il y a forcément utilisation d’énergie chimique : l’ADN hélicase utilise de l’ATP.
La fourche de réplication
Comment la structure atomique de l’ADN hélicase permet-il le déplacement du brin d’ADN avec l’hydrolyse d’ATP?
L’ADN hélicase est composée de 6 sous-unité avec des protéines en conformation “hairpin”, de manière à faire un escalier spiralé pour l’ADN (en haut, 5’ de l’ADN, en bas, 3’).
Le mouvement des protéines permet le mouvement de l’ADN :
1. Au top de la structure : lié à ATP
2. Milieu : lié à ADP
3. Bas : aucun nucléotide
4. L’ADN circule entre les différents étages par le mouvement des protéines.
La fourche de réplication
Comment le brin d’ADN est-il délié de son autre brin par l’ADN hélicase et sa structure atomique?
Le milieu de l’ADN hélicase fait un diamètre de 13 armstrong, alors que le double brin fait un diamètre de 20 armstrong.
La fourche de réplication
Grâce à quelles protéines les ADN simple brins générés par l’hélicase restent sans pairage avant leur utilisation comme template?
Par les SSB (ssDNA-binding proteins, protéine liants d’ADN simple brin).
La fourche de réplication
Pourquoi les SSB sont-ils un example de liaison coopérative?
Les molécules de SSB facilite la liaison de la prochaine SSB adjacente (car elle se lie à la fois à l’ADN et à l’autre SSB), ce qui permet de rapidement lier plusieurs protéines sur l’ADN simple brin après le passage de l’hélicase.
La fourche de réplication
Est-ce que la liaison des SSB et de l’ADN dépend des paires de bases?
Non, la liaison est effectuée principalement par des intéractions électrostatique avec le squelette phosphate et des intéractions d’empilement avec les bases (et rarement de liens hydrogènes avec les bases).
La fourche de réplication
Qu’arrive-t-il à l’ADN double brin lors de sa séparation par l’ADN hélicase?
(Surenroulement)
L’ADN devient de plus en plus positivement surenroulé et nécessite donc un mécanisme qui permet d’enlever l’accumulation de surenroulement.
La fourche de réplication
Par quelles enzymes le surenroulement de l’ADN est-il enlevé?
Par les gyrases ou topoisomérases, qui clivent soit un ou les deux brins d’ADN, et passent un des deux brins à travers l’autre.
La spécialisation des ADN polymérases
Qu’a permis le rôle centra de réplication efficace et précise des ADN polymérases dans l’évolution?
L’évolution de plusieurs ADN polymérases spécialisées.
Par exemple, E. coli possède au moins 5 polymérases distinctes par leurs propriétés enzymatiques, leur composition et leur abondance.
La spécialisation des ADN polymérases
Quelle est l’enzyme principale de réplication du chromosome chez E. coli et pourquoi?
ADN polymérase III (ADN pol 3), car cette polymérase est très processive (comme le génome entier est répliqué par deux fourches de réplication).
La spécialisation des ADN polymérases
Qu’est-ce qui confère à l’ADN pol 3 une haute processivité?
L’ADN pol 3 fait partir d’un complexe nommée “ADN Pol 3 holoenzyme”.
La spécialisation des ADN polymérases
Pour quelle utilisation ADN pol 1 est il spécialisé chez E. Coli?
Pour enlever les primer d’ARN utilisés pour initier la synthèse d’ADN.
Leur exonucléase 5’ permet à ADN pol 1 d’Enlever l’ARN ou l’ADN directement en amont du site de synthèse d’ADN, et aussi le lien résistant à la RNase H.
La spécialisation des ADN polymérases
À quoi servent les 3 autres ADN pol (qui ne sont pas ADN pol 1 et ADN pol 3) de E.coli, et quelle est la une différence entre ces 3 polymérases et les deux polymérases de réplication?
À la réparation de l’ADN : elle ne possèdent pas d’endonucléases associées car elles n’ont pas besoin d’être très précises.
La spécialisation des ADN polymérases
Combien d’ADN polymérase possèdent les cellules eucaryote et combien sont nécessaires pour la duplication du génome?
Généralement + de 15. 3 d’entre elles sont essentielles à la duplication du génome.
La spécialisation des ADN polymérases
Quelles sont les polymérases essentiels chez les eucaryotes?
ADN pol ẟ (delta)
ADN pol ε (epsilon)
ADN pol α/primase
La spécialisation des ADN polymérases
Expliquez l’interaction entre les trois polymérases essentielles chez les eucaryotes.
ADN pol α/primase : 2 sous-unité de polymérase et 2 sous-unité de primase : initie le nouveau brin d’ADN et son primer, ce qui permet à la polymérase de commencer la synthèse.
ADN pol α : petite procéssivité, donc après l’initiation, elle est rapidement remplacée par l’ADN pol ẟ (brin retardé) et l’ADN pol ε (brin meneur).
La spécialisation des ADN polymérases
Comment les ADN polymérases à la fourche de réplication peuvent-ils avoir une procéssivité aussi grande?
Grâce à l’association des polymérases à des protéines appelées “sliding DNA clamps” (attaches).
La spécialisation des ADN polymérases
Qu’est-ce qui permet aux attaches de se déplacer sur l’ADN?
Leur formation en anneau leur permet d’encercler l’ADN double brin et de laisser de la place pour une couche d’une ou deux molécules d’eau entre la protéine et l’ADN, ce qui lui permet de glisser sur l’ADN sans se dissocier.
Elles peuvent aussi s’attacher aux polymérases liés à la jonction primer:template.
La spécialisation des ADN polymérases
Comment les attaches sont elles en mesure d’accélérer la processivité?
Les ADN polymérases de séparent de l’ADN template une fois au 20 à 100 pb synthétisé : l’attache permet de garder la polymérase et l’ADN proche pour empêcher l’ADN pol de se diffuser.
La spécialisation des ADN polymérases
Comment l’ADN pol est elle séparée du double brin d’ADN complété et de l’attache?
Il y a un changement d’affinité entre la polymérase et l’attache, qui dépend de l’ADN lié : avec de l’ADN simple brin dans le site actif, l’affinité est forte, mais avec de l’ADN double brin, l’affinité est faible.
La spécialisation des ADN polymérases
Après la libération de l’ADN pol, l’attache est-elle directement enlevée de l’ADN?
Non, d’autres protéines intéragissent avec les protéines d’attaches, comme des protéines associées aux fragments d’Okazaki.
La spécialisation des ADN polymérases
Comment les attaches sont-elles placées sur l’ADN?
À partir de chargeurs d’attache (sliding clamp loaders) qui catalysent l’ouverture de l’anneau de l’attache et son placement sur l’ADN.
Elles peuvent aussi enlever les attaches.
La spécialisation des ADN polymérases
Les chargeurs d’attache ont-ils besoin d’ATP pour placer les attaches sur l’ADN et pour les enlever?
L’ATP est nécessaire pour placer les attaches sur l’ADN.
Aucun ATP n’est nécessaire pour les enlever.
La spécialisation des ADN polymérases
Comment le chargement d’attaches et leur enlèvement est-il contrôlé?
Il y a une attache qui est chargée à chaque fois qu’une jonction primer:template est présente. Le chargeur d’attache s’occupe de placer et d’enlever l’attache.
La spécialisation des ADN polymérases
Vrai ou faux? Les chargeurs d’attache peuvent intéragir avec l’attache en même temps que les polymérases.
Faux : ils ont un site de liaison qui se chevauchent : il est donc impossible pour le chargeur d’atteindre une attache qui est lié à une polymérase, ou toute autre enzyme qui a besoin de l’attache (comme les facteurs d’assemblage du nucléosome, les protéines de réparation de fragments d’Okazaki, et les protéines de réparation d’ADN).
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Quel est le bénéfice de synthétiser l’ADN à partir du brin meneur et du brin retardé simultanément?
Cela limite la quantité d’ADN simple brin dans la cellule. C’est un bénefice car un bris complet dans un chromose serait beaucoup plus difficile à réparer, et pourrait causer plusieurs mutations dans l’ADN.
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Comment l’action des polymérases est-elle coordinée chez E. coli (quelle structure le permet)?
À partir d’un complexe multiprotéique appelée l’ADN pol 3 holoenzyme.
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Que contient la structure de l’holoenzyme d’ADN pol 3?
- 3 copies de l’ADN pol 3
- 1 copie d’un chargeur d’attache à 5 sous-unités (dont trois protéine τ (tau) qui se lie chacune à une ADN pol 3)
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Expliquez le processus de l’holoenzyme d’ADN pol 3 lors de la synthèse d’ADN (modèle du trombone).
- Pendant que l’hélicase dénoue l’ADN : la première ADN pol 3 commence à synthétiser l’ADN sur le brin meneur.
- Des SSB s’accroche au brin retardé et des primases agissent avec l’hélicase pour synthétiser des nouveaux primer sur le brin retardé
- Avec le chargeur d’attache, une attache est assemblée sur le brin retardé et une 2e ADN pol 3 initie la synthèse grâce à l’attache (chargée par le chargeur d’attache beta de l’holoenzyme).
- À la fin de la synthèse du fragment d’Okazaki, la polymérase 3 se décroche et se racroche à la prochaine attache chargée, puis la polymérase 1 (pas dans l’holoenzyme) remplace le primer.
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Chez les eucaryotes, quelle(s) polymérase(s) sont associées au brin meneur et au brin retardé?
- ADN pol epsilon : brin meneur
- ADN pol alpha/primase + ADN pol delta : brin retardé
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Nommez deux intéractions protéine-protéine entre les protéines de la fourche de réplication (chez E. coli) qui permettent de faciliter grandement la progression de la fourche de réplication.
- L’interaction entre l’hélicase et l’holoenzyme d’ADN pol 3 : les sous-unité tau tiennent l’hélicase et l’holoenzyme ensemble et stimule l’Activité de l’hélicase par un facteur 10 (l’hélicase ralentit si elle n’est pas associée à l’ADN polymérase)
- L’interaction entre l’ADN hélicase et la primase : une fois par seconde, la primase s’associe à l’hélicase et le brin avec des SSB : cela stimule fortement la fonction de la primase (1000x).
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Comment s’apelle la combinaison totale des protéines fonctionnant à la fourche de réplication?
Un réplisome
Synthèse d’ADN à la fourche de réplication
Que permet le réplisome?
Les intéractions entre plusieurs enzymes spécifiques permettent d’Améliorer l’efficacité de la réplication d’ADN.
L’initiation de la réplication de l’ADN
Qu’a besoin la formation initiale de la fourche de réplication?
Une séparation des deux brins d’ADN pour donner les ADN simple brin nécessaire à la liaison de l’hélicase et pour agir comme matrice de synthèse du primer et de la nouvelle ADN.
L’initiation de la réplication de l’ADN
Où commence la synthèse d’ADN (dans le double brin d’ADN/chromosome)?
Dans des régions internes du chromosome (bien qu’il soit plus facile de l’initier aux extrémités des chromosomes)
L’initiation de la réplication de l’ADN
Comment s’apellent les sites d’ouvertur de l’ADN?
Les origines de réplication
L’initiation de la réplication de l’ADN
Expliquez le modèle du replicon?
Il s’agit d’un modèle qui explique les évènements controllant l’initiation de la réplication chez les bactéries.
Deux composantes :
* Le réplicateur : séquences d’ADN qui sont suffisantes pour diriger la réplication (le site de réplication fait toujours partie du réplicateur)
* L’initiateur : protéine qui reconnait un élément de l’ADN du réplicateur et active l’initiation de la réplication (toujours régulé par l’ATP)
L’initiation de la réplication de l’ADN
Vrai ou faux? Il existe plusieurs protéines (dans la réplications) qui se lie à une séquence spécifique d’ADN.
Faux, seulement l’initiateur peut se lier à une séquence spécifique d’ADN.
L’initiation de la réplication de l’ADN
Quelles sont les deux points en commun de tous les réplicateurs connus?
- Ils incluent un site de liaison pour la protéine initiatrice (nucléation de l’assemblage de la machinerie d’initiation de la réplication)
- Ils incluent une séquence riche en AT d’ADN qui se dénoue facilement mais pas spontanément (contrôlée par les protéines initiatrices)
L’initiation de la réplication de l’ADN
Comment s’apelle le seul réplicateur d’E. coli?
OriC
L’initiation de la réplication de l’ADN
À quoi réfère-t-on lorsqu’on parle de DnaA?
Il s’agit de la protéine initiatrice de la réplication chez E. Coli.
L’initiation de la réplication de l’ADN
Quels sont les deux motifs répétés qui sont critiques à la fonction d’OriC?
Un motif 9-mer (?) répété 5 fois, qui sert de site de liaison pour DnaA.
Un motif 13-mer répété 3 fois, qui est le site initiale de la formation d’ADN simple brin durant l’initiation.
Sélection de l’origine et activation par protéine initiatrice
Quelles sont les deux à trois différentes fonctions des protéines initiatrices?
- Se lier à l’ADN réplicateur (via un site de liaison spécifique)
- Intéragir avec des facteurs additionnels requis pour l’initiation de la réplication
- Certaines protéines initiatrices aussi créent une distortion ou dénoue la région de l’ADN adjacent à leur site de liaison pour faciliter l’ouverture initiale du duplex d’ADN.
Sélection de l’origine et activation par protéine initiatrice
Quelles est la fonction de chacun des deux domaines de DnaA
Un domaine se lie aux élément 9-mer d’oriC (sous forme double brin)
Un autre domaine intéragit avec la région des répétitions 13-mer d’oriC qui permet la séparation des brins d’ADN sur une zone de plus de 20 bp.
L’ADN simple brin est maintenue en conformation qui prévient la formation de plus de 3 paires de bases continues (garde l’ADN simple brin).
Sélection de l’origine et activation par protéine initiatrice
Chez les cellules eucaryotes, quel est l’initiateur?
Un complexe de 6 protéines appelée “origine recognition complex (ORC)” ou complexe de reconnaissance de l’origine.
Sélection de l’origine et activation par protéine initiatrice
Expliquez le fonctionnement du complexe de reconnaissance de l’origine chez les levures?
ORC reconnait une séquence conservée du réplicateur des levures (élément A) et une deuxième séquence moins conservée (élément B1).
ORC lie et hydrolyse l’ATP (comme DnaA) : la liaison d’ATP sert à la liaison à l’ADN à l’origine, et l’hydrolyse sert à faire charger l’hélicase sur l’ADN réplicateur.
Sélection de l’origine et activation par protéine initiatrice
Une fois que DnaA est lié à OriC et dénoue l’ADN 13-mer, que se passe-t-il?
- DnaA + ADN simple brin recrute un complexe de deux protéines : ADN hélicase (DnaB) + chargeur d’hélicase (DnaC) (le chargeur empêche le fonctionnement de l’hélicase)
- DnaC dirige l’assemblement de l’hélicase à travers l’ADN simple brin (ADN à l’intérieur de l’anneau, processus simplaire aux attaches) avec de l’ATP
- L’hélicase recrute le reste de la machinerie de la réplication (primase, pour synthétiser un nouveau primer) ce qui cause la libération du chargeur d’hélicase (donc l’hélicase s’active)
- L’holoenzyme ADN pol 3 recruté, attaches sont chargés sur les primers, les polymérases s’activent, les SSB se lient, la primase synthétise le premier primer du brin retardé, …
- Initiation complété avec comme résultat 2 fourches de réplications.
Fin de la réplication
À la fin de la réplication d’un chromosome circulaire, où se retrouve la nouvelle ADN?
Les deux molécules d’ADN sont topologiquement liés entre elles.
Fin de la réplication
Quelle est la solution au problème des deux brins d’ADN liés ensemble à la fin de la réplication?
L’utilisation de topoisomérases de type 2 pour séparer les deux brins.
Quelle séquence se trouve à l’extrémité des amorces?
séquence pppag (phosphate + phosphate + phosphate + a + g)
En quoi est converti l’ADN circulaire simple-brin du bactériophage M-13?
Une forme duplex circulaire (forme réplicative - RF)
Quelle est la différence entre RF1 et RF2 (bactériophage M-13)
RF 1 : superenroulé
RF2 : porteuse d’une cassure simple brin
Vrai ou faux? La conversion de la forme virale de l’ADN du bactériophage phiX174 en forme réplicative est plus complexe que chez m13? Justifiez.
Vrai, la réplication se fait grâce au primosome.
Comment le signal enclenchant chaque cycle de réplication est-il produit (régulation)?
La métyhlation de l’ADN joue un rôle important : une méthylase (Dam) reconnait la séquence palindromique GATC (11 fois dans oriC) et ajoute un groupement méthyle au N6 de l’adénine des brins opposés.
Que permet de distinguer le degré de méthylation dans les origines de réplication?
Le degré de méthylation permet à la machinerie d’initiation de distinguer une origine répliquée vs non-répliquée (2 molécules d’ADN hémi-méthylées produites après le passage d’une fourche)
Quelle protéine est nécessaire à l’arrêt de la progression d’une fourche de réplication?
La protéine TUS (terminator utilization substance) qui se lie spécifiquement aux sites ter (terA, terB, terC, terD, terE, terF)
Comment la protéine Tus permet l’arrêt de la progression?
Elle inhib l’hélicase DnaB, et arrête le mouvement de la fourhce de réplication dans une seule direction (nature asymétrique).
Quelles sont les 6 propriétés qui expliquent le faible taux d’erreur dans l’ADN?
- Cellules maintiennent des niveaux équilibrés en dNTP
- Polymérase très fidèle à cause du mécanisme en 2 étapes
- Fonctions des exonucléases détectent et éliminent les erreurs
- Ils existent d’autres systèmes enzymatiques de correction
- Les ADN pol doivent avoir un amorce pour initier l’élongation
- Les polymérases ne peuvent pas synthétiser dans le sens 3’ - 5’
Nommez toutes les enzymes de la réplication de l’ADN
- Gyrase
- Hélicase (DnaB)
- Protéines SSB
- Primases (DnaG)
- Réplicases (holoenzyme pol 3)
- Enzyme retirant les amorces (RNase H ou Pol I)
- Ligase pour lier fragments d’okazaki.
