RNA-regulierte Systeme Flashcards
RNA-Sekundärstrukturen (Bildungselemente)
Single Strand Double Strand Single Nucleotide Bulge Three Nucleotide Bulge Hairpin (Stemloop) Symmetrical Internal Loop Two-Stem Junction Three-Stem-Junction
RNA-Tertiärstrukturen (Bildungselemente)
koaxiale Basenpaarung (bei 2 Stems) Kissing Hairpin Pseudoknoten: Loop bindet mit wenigen NTs an entfernten Single Strand
Riboswitches (allgemein)
cis-agierendes RNA-Element mit komplexer Struktur (evolutionär konserviert)
cis = codierung d. Elements an Ort d. RNA
komplexe Struktur: hochspezifische Ligandenbindung, Strukturänderung bei Ligandenbindung, Regulation d. Genexpression
Riboswitches Funktionsweise
Aptamer-Domäne (AD): 35-200NT, bindet Ligand über Induced-Fit
Expressionsplattform (EP): löst regulatorische Signale aus, Modularisiert Transkription/Translation
Switching Sequence (SS): determiniert Riboswitch-Konformation, ohne Ligand gebunden an EP, mit Ligand gebunden an AD
Liganden von Riboswitches
Coenzyme: Vit B, S-Adenosylmethionin, S-Adenosylhomocystein, Molybdän-Cofaktor
Nucleobasen(derivate): preQ1, zykl. di-GMP
Aminosäuren
Zucker
Ionen
Vitamin-Derivate
RNA-Komponenten
Regulierungen durch Riboswitches (generell)
negative Regulierung (Feedback-Loops), Biosynthese, Transport, Verfügbarkeit von Cofaktoren, Aktivierung d. Stressantwort, Botenstoff c-di-GMP
Kategorisierung von Riboswitches
Familien & Klassen
Familien: binden gleichen Liganden
Klassen: unterscheiden sich in Sekundär- & Tertiärstruktur
Gleiche Riboswitches in untersch. Bakterien beeinflussen untersch. Dinge
Transkriptionstermination über Off-Switch Funktionsweise
ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung Anti-Terminator-Haarnadel, Transkription
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung Terminator-Haarnadel, keine Transkription
Translationsinhibition über Off-Switch Funktionsweise
ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung Anti-Sequestor, RBS zugängig, Translation
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung Sequestor, RBS unzugängig, Translationsinhibition
Adenin-Riboswitch (On-Switch) Funktionsweise
ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung von Terminator/Sequestor
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung von Anti-Terminator/-Sequestor
Riboswitch-Riboenzym Funktionsweise
Ribozym-Domäne: RNA spaltet Phosphodiesterbindung
Regulation von z.B. Glucosamin-6P-Synthetase
ohne Ligand: Rybozymdomäne bindet an AD, keine Spaltung
mit Ligand: Ligand binet an AD, Ribozymdomäne dissoziiert & schneidet nach 5’-UTR
OH-Erkennung: freies 5’OH wird durch RNase J1 erkannt & RNA wird abgebaut
Riboswitches in welchen Organismen?
Prokaryonten: viele verschiedene, Anpassung d. Stoffwechsels an Umweltfaktoren
Archaeen: in Thermokokken
Eukaryonten: in Hefen, Algen, höheren Pflanzen
TPP-bindende Riboswitches (allgemein)
in Pilzen, Algen, höheren Pflanzen lokalisiert im 3'-UTR alternatives Spleißen führt zu mRNA-Degradation Ligand: TPP Reguliert: THIC
TPP-bindende Riboswitches Funktionsweise
ohne Ligand: mRNA vor PolyA bindet an mRNA dahinter, maskierte 5’-Splicingsite, Transkriptionsstopp nach PolyA, stabiles mRNA-Skript & Translation möglich
mit Ligand: Demaskierung d. 5’-Splicingsite, PolyA wird als Intron gespleißt, keine PolyA und daher instabiles mRNA-Skrip & Translation nicht möglich
RNA-Thermometer (allgemein)
Messen v. Umgebunstemperatur über Sensoren
Sensoren: kleine RNA-Elemente in 5’-Region d. mRNA
Kontrolle verschiedener Stress-Gene
Translationsregulation
Heat-Shock-RNA-Thermometer Funktionsweise
optimale Temp.: Haarnadel maskiert RBS & Startcodon
hohe Temp.: Haarnadelstruktur schmilzt auf, Ribosom bindet an mRNA & translatiert
Aufschmelzen: graduell über ROSE-Element (Hairpin mit wenigen GC-BP)
Temperatursensibilität: Tripelpaarung U&UC, Wobbelpaarung UU, non-Watson-Crick-Paarungen
direkte Reaktion möglich da Sensor & Regulator direkt gekoppelt
virulente RNA-Thermometer
Temperaturanstieg als Signal erfolgreicher Infektion
Induktion d. Expression von Virulenzfaktoren
Kälteschock-Thermometer
Steuert Exprimieren von CspA (Protein)
normale Temp.: RBS & AUG nicht zugänglich, mRNA instabil
kalte Temp.: globale Strukturänderung, RBS & AUG zugänglich, stabile mRNA
trans-codierte sRNAs (generell)
trans-codiert: abseits von Genort
nicht-prozessierte Transkripte: 50-300BP
Termination: rho-unabhängig, über Haarnadel & PolyU
mehrere Targets: partiell komplimentär zu Ziel-RNA
benötigen zusätzl. Proteinfaktoren
Expression: oxidativer Stress, Phospho-Zucker-Stress, Nährstoffmangel, Eisenmangel
trans-codierte sRNAs Funktionsweise
Inhibition: sRNA bindet an Komplimentärstelle der mRNA, mRNA kann nicht mehr abgelesen werden, wird meist durch RNase E/III abgebaut
Aktivierung: sRNA binet an Komplimentärstelle in Teil von Loop der z.B. RBS verdeckt, RBS liegt nun frei, mRNA kann Translatiert werden
MicA (sRNA) Funktionsweise
72NT, Eintritt in stationäre Phase bei E.coli
Fehlfaltung von ompA bei Phaseneintritt -> MicA-Expression
MicA bindet an Shine-Dalgarno-Sequenz -> 30S kann nicht binden
Proteinfaktor Hfq: fördert Hybridisierung, rekrutiert RNase E -> Degradosom-spez. Proteine
An Degradosom beteiligte Proteine
RhlB: Helikase (trennt sRNA von mRNA)
RNase E: baut ssRNA ab
PNPase: 3’-5’-Exoribonuklease (Produkt: Monoribonukleotide)
Enolase: Funktion unbekannt
Hfq Struktur & Funktionsweise
Struktur: Ringförmiges Homohexamer, proximale Bindungsfläche: N-Terminale Helizes, distale Bindungsfläche: C-Terminale unstrukturierte Region
Funktion: proximal: sRNA bindet über ss U-reiche Region in Hairpins
distal: mRNA bindet über ARN-Bindungsmotiv (Purin)
lateral: Arg-Patches (Rim) fördert BP d. RNAs
Sigmafaktor S (sRNA) Funktionsweise
Reguliert Gene bei Stressinduktion
ohne Stress: Haarnadel maskiert RBS, keine Translation
bei Stress: Hfq bindet Sigmafaktor S & DsrA-sRNA (85 NT) -> sRNA bindet Haarnadel, RBS zugänglich, Translation
RNase III spaltet in beiden Fällen, bei Stress aber entfernt von RBS
RNA III-kontrollierte Virulenz Funktionsweise
Herunterregulieren der Virulenzgrenze
Haarnadel von sRNA u. mRNA formen Kissing Hairpin
RNase III schneidet RNA, aber kein Abbau
cis-codierte asRNA (allgemein)
autonom mit eigenem Promotor/Terminator
cis-codiert, trans-agierend
1 Target: komplementär zu Ziel-mRNA
in mobilden DNA-Elementen & Bakteriengenom
50 bis >1000NT: kurze asRNAs überlappen mit 1 ORF, lange asRNAs überlappen mehrere ORFs
asRNAs biologische Funktionen
Regulation: Transkription, Translation, Stabilität
Kontrolle v. Plasmiden (Konjugation)
Kontrolle d. Transposons
Stoffwechselregulation (chromosomal codierte asRNAs)
asRNA-vermittelte Transkriptionstermination
asRNA bindet an polycistronische mRNA -> formen v. Hairpin & Termination
GadY (asRNA) Funktionsweise
Erhöhung d. mRNA-Stabilität
asRNA bindet an intercistronischen Bereich -> Duplex zw. 2 Genen
RNase III spaltet mRNA -> kürzeres Transkript deutlich stabiler
SymE & SymR (asRNA) Funktionsweise
Translationsinhibition
asRNA bindet an 5’-Ende d. mRNA -> Maskierung RBS
Spezialfall: SprA asRNA bildet Hairpin -> imperfekte Duplex mit mRNA
CRISPR/Cas (allgemein)
Adaptives Fremd-DNA-Abwehrsystem in Prokaryonten
CRISPR-Lokus: 1-18 Loki, DNA-Repeats in Bakteriengenom
Cas-Gen: heterogene Gengruppe, an Abwehr beteiligte Proteine
Leader: 100-500BP, Promotor d. CRISPR-Transkription
CRISPR-Lokus: Repeats
23-47 BP lang, 2 bis >100 Repeats/Lokus
palindromische Sequenzen
Länge abhängig v. CRISPR-Typ & Organismus
CRISPR-Lokus: Spacer
21-71 BP lang, 1-100 Spacer/Lokus
hypervariable Sequenzen
Entstammen Phagen- & Plasmid-DNA (Pathogene)
CRISPR-Lokus: Protospacer
Viren-DNA
Sequenzabschnitt von Fremd-DNA
mRNA wird prozessiert und in crRNA eingebaut
CRISPR-Lokus: PAM
Viren-DNA
Protospacer-Adjacent Motif
2-5 BP, flankiert Protospacer & hilft diesen zu erkennen
Cas-Gene
5’ oder 3’ von CRISPR-Lokus codiert
Helikasen, Nukleasen, Polymerasen, etc. (Gen-Prozessierung)
Produkte Bilden Nukleoproteinkomplexe: Bindungsdomänen für DNA/RNA/Nukleotide
sehr variabel (2Klassen & 5 Typen)
CRISPR-Cas-Mechanismus: Acquisition
Adaption/Immunisierung:
- Erkennen d. Fremd-DNA nach Erstinfektion
- Fragmentierung d. Fremd-DNA
- Einbau in CRISPR-Lokus als neuer Spacer
CRISPR-Cas-Mechanismus: Expression & Prozessierung
- Expression d. Cas-Gene
- Transkription d. CRISPR-Arrays zur prä-crRNA
- Prozessierung zu kleinen crRNAs
CRISPR-Cas-Mechanismus: Interferenz
- Erkennung von Fremd-DNA durch Cas-crRNA-Komplex
2. Abbau der Fremd-DNA
Cas1 & Cas2 Funktion & Besonderheiten
Codieren für Komplexe zur Spacer-Integration
Vorhanden in allen CRISPR-Cas-Systemen
Bauen Spacer immer an 3’-Ende ein (Sticky Ends)
Einbauen ohne PAM
Expression & Prozessierung von crRNA in Typ I- Systemen
Repeat-Sequenz formt Hairpin-Struktur
Cas-Endoribonuklease schneidet nach der Haarnadel an 3’-Ende
Keine weitere Prozessierung
Expression & Prozessierung von crRNA in Typ II- Systemen
tracrRNA (transaktivierende RNA) bindet 25 NT an komplementäre Repeat-Sequenz
RNase III schneidet dsRNA
5’-Ende wird getrimmt
Interferenz bei CRISPR/Cas-Typ I Funktionsweise
- Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA am komplementären Strang nach PAM ab
- Cse1 erkennt PAM
- BP (7 NT) zw. crRNA-Seed-Sequenz & Target-DNA
- Komplette BP -> R-Loop
- Rekrutieren Cas3 (Nuklease-Helikase) -> DNA-Degradation
Interferenz bei CRISPR/Cas-Typ II Funktionsweise
- Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA am komplementären Strang nach PAM ab
- Cas9 erkennt PAM
- BP (12 NT) zw. crRNA-Seed-Sequenz & Target-DNA
- Komplette BP -> R-Loop
- Cas 9 (Nuklease) spaltet DNA 3 NT upstream PAM (Blunt Ends)
- DNasen -> DNA-Degradation
Anwendungen für CRISPR/Cas-Systeme
Einbringen Phagenresistenz in wichtige Bakterien
Identifizierung pathogener Bakterien
Gen-Knockdown über Plasmid-codierte CRISPR-Sequenzen
Genome Editing in Eukaryonten
RNAi (RNA-Interferenz) (generell)
Post-transkriptionales Gen-Silencing
Assoziation kleiner dsRNA -> spez. mRNA-Suppression
siRNA: Spaltung d. mRNA
miRNA: Translationsinhibition
katalytische Aktivität: Effekt breitet sich in Gewebe aus
Vererbbar
RNAi in Säugerzellen (lang vs. kurz)
lange RNA: Auslösen unspez. Immunantwort
kurze RNA: transiente, effiziente Suppression
Mechanismus von RNAi
- Dicer-Prozessierung: dsRNA -> kurze siRNA (20-25 BP)
- Bildung von RISC (RNA-induced Silencing Complex): Übergabe v. siRNA über Dicer & dsRBD an AGO
- Guide-Strang-Selektion durch AGO
- Traget-mRNA wird erkannt & gespalten (AGO spaltet endonukleolytisch)
- RISC-Recycling: mRNA entfernt, siRNA bleibt im Komplex
Dicer-Protein Struktur, Funktion
200kDa, Miltidomänenprotein, L-Förmig Spaltet lange dsRNA in kurze Stücke Helicase, DUF: wahrscheinlich Nachholen d. DNA Platform, PAZ: Binden d. ssRNA Ruler: Abstand ssRNA & dsRNA RNase III: Schnitt d. dsRNA dsRBD: Binden d. dsRNA
AGO-Protein Struktur, Funktion
100kDa, Multidomänenprotein, Faltung ähnlich RNase H
Katalytische Tetrade (AspGluAspHis)
N, L1, PAZ, L2, MID
PIWI: katalytische Komponente
Enden von siRNA-Molekülen
3’-Enden: Hydroxylgruppe, 2 NT Überhang
5’-Enden: Monophosphat, Spaltstelle 10-11 NT entfernt
Passenger-Strang von siRNA-Molekülen
identisch zu Target-mRNA
Spaltung durch AGO2
Entfernung aus RISC
Degradation durch Ribonukleasen
Guide-Strang von siRNA-Molekülen
komplementär zur Tagret-mRNA
definiert Spaltstellen d. Passenger-RNA
definiert Spaltstellen d. Target-mRNA
Biologische Bedeutung von RNAi
Schutz vor viraler Infektion Genomstabilität aufrecht erhalten siRNA-mediated Knockdowns: Gen-Untersuchung Therapieansatz Bekämpfung v. Pflanzenschädlingen
Antivirale RNAi Funktionsweise
Virenabwehr
RdRP (RNA-abhängige RNA-Pol) synthetisiert 2. Strang direkt an virale ssRNA -> dsRNA wird über RNAi abgebaut
RNAi-Modifikation zur Wirkungsverstärkung Funktionsweise
- DCR1 (Dicer) erkennt virale dsRNA & schneidet
- RDE1 (primäres AGO) bindet siRNA & Target-mRNA
- RDE1 rekrutiert RRF1 (RNA-Pol)
- RRF1 synthetisiert siRNA upstream d. bereits vorhandenen siRNA (Primer-los, de novo)
- WAGO (sekundäres AGO) assoziiert mit neuen siRNAs
- > höheres siRNA-Level, große Target-Sequenz abgedeckt
