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Molekularbiologie WiSe20/21 > RNA-regulierte Systeme > Flashcards

RNA-regulierte Systeme Flashcards

1
Q

RNA-Sekundärstrukturen (Bildungselemente)

A 
Single Strand
Double Strand
Single Nucleotide Bulge
Three Nucleotide Bulge
Hairpin (Stemloop)
Symmetrical Internal Loop
Two-Stem Junction
Three-Stem-Junction
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2
Q

RNA-Tertiärstrukturen (Bildungselemente)

A 
koaxiale Basenpaarung (bei 2 Stems)
Kissing Hairpin
Pseudoknoten: Loop bindet mit wenigen NTs an entfernten Single Strand
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3
Q

Riboswitches (allgemein)

A

cis-agierendes RNA-Element mit komplexer Struktur (evolutionär konserviert)
cis = codierung d. Elements an Ort d. RNA
komplexe Struktur: hochspezifische Ligandenbindung, Strukturänderung bei Ligandenbindung, Regulation d. Genexpression

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4
Q

Riboswitches Funktionsweise

A

Aptamer-Domäne (AD): 35-200NT, bindet Ligand über Induced-Fit
Expressionsplattform (EP): löst regulatorische Signale aus, Modularisiert Transkription/Translation
Switching Sequence (SS): determiniert Riboswitch-Konformation, ohne Ligand gebunden an EP, mit Ligand gebunden an AD

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5
Q

Liganden von Riboswitches

A

Coenzyme: Vit B, S-Adenosylmethionin, S-Adenosylhomocystein, Molybdän-Cofaktor
Nucleobasen(derivate): preQ1, zykl. di-GMP
Aminosäuren
Zucker
Ionen
Vitamin-Derivate
RNA-Komponenten

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6
Q

Regulierungen durch Riboswitches (generell)

A

negative Regulierung (Feedback-Loops), Biosynthese, Transport, Verfügbarkeit von Cofaktoren, Aktivierung d. Stressantwort, Botenstoff c-di-GMP

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7
Q

Kategorisierung von Riboswitches

A

Familien & Klassen
Familien: binden gleichen Liganden
Klassen: unterscheiden sich in Sekundär- & Tertiärstruktur
Gleiche Riboswitches in untersch. Bakterien beeinflussen untersch. Dinge

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8
Q

Transkriptionstermination über Off-Switch Funktionsweise

A

ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung Anti-Terminator-Haarnadel, Transkription
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung Terminator-Haarnadel, keine Transkription

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9
Q

Translationsinhibition über Off-Switch Funktionsweise

A

ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung Anti-Sequestor, RBS zugängig, Translation
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung Sequestor, RBS unzugängig, Translationsinhibition

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10
Q

Adenin-Riboswitch (On-Switch) Funktionsweise

A

ohne Ligand: SS & EP binden, Ausbildung von Terminator/Sequestor
mit Ligand: SS & AD binden, Ausbildung von Anti-Terminator/-Sequestor

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11
Q

Riboswitch-Riboenzym Funktionsweise

A

Ribozym-Domäne: RNA spaltet Phosphodiesterbindung
Regulation von z.B. Glucosamin-6P-Synthetase
ohne Ligand: Rybozymdomäne bindet an AD, keine Spaltung
mit Ligand: Ligand binet an AD, Ribozymdomäne dissoziiert & schneidet nach 5’-UTR
OH-Erkennung: freies 5’OH wird durch RNase J1 erkannt & RNA wird abgebaut

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12
Q

Riboswitches in welchen Organismen?

A

Prokaryonten: viele verschiedene, Anpassung d. Stoffwechsels an Umweltfaktoren
Archaeen: in Thermokokken
Eukaryonten: in Hefen, Algen, höheren Pflanzen

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13
Q

TPP-bindende Riboswitches (allgemein)

A 
in Pilzen, Algen, höheren Pflanzen
lokalisiert im 3'-UTR
alternatives Spleißen führt zu mRNA-Degradation
Ligand: TPP
Reguliert: THIC
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14
Q

TPP-bindende Riboswitches Funktionsweise

A

ohne Ligand: mRNA vor PolyA bindet an mRNA dahinter, maskierte 5’-Splicingsite, Transkriptionsstopp nach PolyA, stabiles mRNA-Skript & Translation möglich
mit Ligand: Demaskierung d. 5’-Splicingsite, PolyA wird als Intron gespleißt, keine PolyA und daher instabiles mRNA-Skrip & Translation nicht möglich

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15
Q

RNA-Thermometer (allgemein)

A

Messen v. Umgebunstemperatur über Sensoren
Sensoren: kleine RNA-Elemente in 5’-Region d. mRNA
Kontrolle verschiedener Stress-Gene
Translationsregulation

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16
Q

Heat-Shock-RNA-Thermometer Funktionsweise

A

optimale Temp.: Haarnadel maskiert RBS & Startcodon
hohe Temp.: Haarnadelstruktur schmilzt auf, Ribosom bindet an mRNA & translatiert
Aufschmelzen: graduell über ROSE-Element (Hairpin mit wenigen GC-BP)
Temperatursensibilität: Tripelpaarung U&UC, Wobbelpaarung UU, non-Watson-Crick-Paarungen
direkte Reaktion möglich da Sensor & Regulator direkt gekoppelt

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17
Q

virulente RNA-Thermometer

A

Temperaturanstieg als Signal erfolgreicher Infektion

Induktion d. Expression von Virulenzfaktoren

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18
Q

Kälteschock-Thermometer

A

Steuert Exprimieren von CspA (Protein)
normale Temp.: RBS & AUG nicht zugänglich, mRNA instabil
kalte Temp.: globale Strukturänderung, RBS & AUG zugänglich, stabile mRNA

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19
Q

trans-codierte sRNAs (generell)

A

trans-codiert: abseits von Genort
nicht-prozessierte Transkripte: 50-300BP
Termination: rho-unabhängig, über Haarnadel & PolyU
mehrere Targets: partiell komplimentär zu Ziel-RNA
benötigen zusätzl. Proteinfaktoren
Expression: oxidativer Stress, Phospho-Zucker-Stress, Nährstoffmangel, Eisenmangel

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20
Q

trans-codierte sRNAs Funktionsweise

A

Inhibition: sRNA bindet an Komplimentärstelle der mRNA, mRNA kann nicht mehr abgelesen werden, wird meist durch RNase E/III abgebaut
Aktivierung: sRNA binet an Komplimentärstelle in Teil von Loop der z.B. RBS verdeckt, RBS liegt nun frei, mRNA kann Translatiert werden

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21
Q

MicA (sRNA) Funktionsweise

A

72NT, Eintritt in stationäre Phase bei E.coli
Fehlfaltung von ompA bei Phaseneintritt -> MicA-Expression
MicA bindet an Shine-Dalgarno-Sequenz -> 30S kann nicht binden
Proteinfaktor Hfq: fördert Hybridisierung, rekrutiert RNase E -> Degradosom-spez. Proteine

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22
Q

An Degradosom beteiligte Proteine

A

RhlB: Helikase (trennt sRNA von mRNA)
RNase E: baut ssRNA ab
PNPase: 3’-5’-Exoribonuklease (Produkt: Monoribonukleotide)
Enolase: Funktion unbekannt

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23
Q

Hfq Struktur & Funktionsweise

A

Struktur: Ringförmiges Homohexamer, proximale Bindungsfläche: N-Terminale Helizes, distale Bindungsfläche: C-Terminale unstrukturierte Region
Funktion: proximal: sRNA bindet über ss U-reiche Region in Hairpins
distal: mRNA bindet über ARN-Bindungsmotiv (Purin)
lateral: Arg-Patches (Rim) fördert BP d. RNAs

24
Q

Sigmafaktor S (sRNA) Funktionsweise

A

Reguliert Gene bei Stressinduktion
ohne Stress: Haarnadel maskiert RBS, keine Translation
bei Stress: Hfq bindet Sigmafaktor S & DsrA-sRNA (85 NT) -> sRNA bindet Haarnadel, RBS zugänglich, Translation
RNase III spaltet in beiden Fällen, bei Stress aber entfernt von RBS

25
Q

RNA III-kontrollierte Virulenz Funktionsweise

A

Herunterregulieren der Virulenzgrenze
Haarnadel von sRNA u. mRNA formen Kissing Hairpin
RNase III schneidet RNA, aber kein Abbau

26
Q

cis-codierte asRNA (allgemein)

A

autonom mit eigenem Promotor/Terminator
cis-codiert, trans-agierend
1 Target: komplementär zu Ziel-mRNA
in mobilden DNA-Elementen & Bakteriengenom
50 bis >1000NT: kurze asRNAs überlappen mit 1 ORF, lange asRNAs überlappen mehrere ORFs

27
Q

asRNAs biologische Funktionen

A

Regulation: Transkription, Translation, Stabilität
Kontrolle v. Plasmiden (Konjugation)
Kontrolle d. Transposons
Stoffwechselregulation (chromosomal codierte asRNAs)

28
Q

asRNA-vermittelte Transkriptionstermination

A

asRNA bindet an polycistronische mRNA -> formen v. Hairpin & Termination

29
Q

GadY (asRNA) Funktionsweise

A

Erhöhung d. mRNA-Stabilität
asRNA bindet an intercistronischen Bereich -> Duplex zw. 2 Genen
RNase III spaltet mRNA -> kürzeres Transkript deutlich stabiler

30
Q

SymE & SymR (asRNA) Funktionsweise

A

Translationsinhibition
asRNA bindet an 5’-Ende d. mRNA -> Maskierung RBS
Spezialfall: SprA asRNA bildet Hairpin -> imperfekte Duplex mit mRNA

31
Q

CRISPR/Cas (allgemein)

A

Adaptives Fremd-DNA-Abwehrsystem in Prokaryonten
CRISPR-Lokus: 1-18 Loki, DNA-Repeats in Bakteriengenom
Cas-Gen: heterogene Gengruppe, an Abwehr beteiligte Proteine
Leader: 100-500BP, Promotor d. CRISPR-Transkription

32
Q

CRISPR-Lokus: Repeats

A

23-47 BP lang, 2 bis >100 Repeats/Lokus
palindromische Sequenzen
Länge abhängig v. CRISPR-Typ & Organismus

33
Q

CRISPR-Lokus: Spacer

A

21-71 BP lang, 1-100 Spacer/Lokus
hypervariable Sequenzen
Entstammen Phagen- & Plasmid-DNA (Pathogene)

34
Q

CRISPR-Lokus: Protospacer

A

Viren-DNA
Sequenzabschnitt von Fremd-DNA
mRNA wird prozessiert und in crRNA eingebaut

35
Q

CRISPR-Lokus: PAM

A

Viren-DNA
Protospacer-Adjacent Motif
2-5 BP, flankiert Protospacer & hilft diesen zu erkennen

36
Q

Cas-Gene

A

5’ oder 3’ von CRISPR-Lokus codiert
Helikasen, Nukleasen, Polymerasen, etc. (Gen-Prozessierung)
Produkte Bilden Nukleoproteinkomplexe: Bindungsdomänen für DNA/RNA/Nukleotide
sehr variabel (2Klassen & 5 Typen)

37
Q

CRISPR-Cas-Mechanismus: Acquisition

A

Adaption/Immunisierung:

  1. Erkennen d. Fremd-DNA nach Erstinfektion
  2. Fragmentierung d. Fremd-DNA
  3. Einbau in CRISPR-Lokus als neuer Spacer
38
Q

CRISPR-Cas-Mechanismus: Expression & Prozessierung

A
  1. Expression d. Cas-Gene
  2. Transkription d. CRISPR-Arrays zur prä-crRNA
  3. Prozessierung zu kleinen crRNAs
39
Q

CRISPR-Cas-Mechanismus: Interferenz

A
  1. Erkennung von Fremd-DNA durch Cas-crRNA-Komplex

2. Abbau der Fremd-DNA

40
Q

Cas1 & Cas2 Funktion & Besonderheiten

A

Codieren für Komplexe zur Spacer-Integration
Vorhanden in allen CRISPR-Cas-Systemen
Bauen Spacer immer an 3’-Ende ein (Sticky Ends)
Einbauen ohne PAM

41
Q

Expression & Prozessierung von crRNA in Typ I- Systemen

A

Repeat-Sequenz formt Hairpin-Struktur
Cas-Endoribonuklease schneidet nach der Haarnadel an 3’-Ende
Keine weitere Prozessierung

42
Q

Expression & Prozessierung von crRNA in Typ II- Systemen

A

tracrRNA (transaktivierende RNA) bindet 25 NT an komplementäre Repeat-Sequenz
RNase III schneidet dsRNA
5’-Ende wird getrimmt

43
Q

Interferenz bei CRISPR/Cas-Typ I Funktionsweise

A
  1. Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA am komplementären Strang nach PAM ab
  2. Cse1 erkennt PAM
  3. BP (7 NT) zw. crRNA-Seed-Sequenz & Target-DNA
  4. Komplette BP -> R-Loop
  5. Rekrutieren Cas3 (Nuklease-Helikase) -> DNA-Degradation
44
Q

Interferenz bei CRISPR/Cas-Typ II Funktionsweise

A
  1. Cascade-Komplex sucht Fremd-DNA am komplementären Strang nach PAM ab
  2. Cas9 erkennt PAM
  3. BP (12 NT) zw. crRNA-Seed-Sequenz & Target-DNA
  4. Komplette BP -> R-Loop
  5. Cas 9 (Nuklease) spaltet DNA 3 NT upstream PAM (Blunt Ends)
  6. DNasen -> DNA-Degradation
45
Q

Anwendungen für CRISPR/Cas-Systeme

A

Einbringen Phagenresistenz in wichtige Bakterien
Identifizierung pathogener Bakterien
Gen-Knockdown über Plasmid-codierte CRISPR-Sequenzen
Genome Editing in Eukaryonten

46
Q

RNAi (RNA-Interferenz) (generell)

A

Post-transkriptionales Gen-Silencing
Assoziation kleiner dsRNA -> spez. mRNA-Suppression
siRNA: Spaltung d. mRNA
miRNA: Translationsinhibition
katalytische Aktivität: Effekt breitet sich in Gewebe aus
Vererbbar

47
Q

RNAi in Säugerzellen (lang vs. kurz)

A

lange RNA: Auslösen unspez. Immunantwort

kurze RNA: transiente, effiziente Suppression

48
Q

Mechanismus von RNAi

A
  1. Dicer-Prozessierung: dsRNA -> kurze siRNA (20-25 BP)
  2. Bildung von RISC (RNA-induced Silencing Complex): Übergabe v. siRNA über Dicer & dsRBD an AGO
  3. Guide-Strang-Selektion durch AGO
  4. Traget-mRNA wird erkannt & gespalten (AGO spaltet endonukleolytisch)
  5. RISC-Recycling: mRNA entfernt, siRNA bleibt im Komplex
49
Q

Dicer-Protein Struktur, Funktion

A 
200kDa, Miltidomänenprotein, L-Förmig
Spaltet lange dsRNA in kurze Stücke
Helicase, DUF: wahrscheinlich Nachholen d. DNA
Platform, PAZ: Binden d. ssRNA
Ruler: Abstand ssRNA & dsRNA
RNase III: Schnitt d. dsRNA
dsRBD: Binden d. dsRNA
50
Q

AGO-Protein Struktur, Funktion

A

100kDa, Multidomänenprotein, Faltung ähnlich RNase H
Katalytische Tetrade (AspGluAspHis)
N, L1, PAZ, L2, MID
PIWI: katalytische Komponente

51
Q

Enden von siRNA-Molekülen

A

3’-Enden: Hydroxylgruppe, 2 NT Überhang

5’-Enden: Monophosphat, Spaltstelle 10-11 NT entfernt

52
Q

Passenger-Strang von siRNA-Molekülen

A

identisch zu Target-mRNA
Spaltung durch AGO2
Entfernung aus RISC
Degradation durch Ribonukleasen

53
Q

Guide-Strang von siRNA-Molekülen

A

komplementär zur Tagret-mRNA
definiert Spaltstellen d. Passenger-RNA
definiert Spaltstellen d. Target-mRNA

54
Q

Biologische Bedeutung von RNAi

A 
Schutz vor viraler Infektion
Genomstabilität aufrecht erhalten
siRNA-mediated Knockdowns: Gen-Untersuchung
Therapieansatz
Bekämpfung v. Pflanzenschädlingen
55
Q

Antivirale RNAi Funktionsweise

A

Virenabwehr

RdRP (RNA-abhängige RNA-Pol) synthetisiert 2. Strang direkt an virale ssRNA -> dsRNA wird über RNAi abgebaut

56
Q

RNAi-Modifikation zur Wirkungsverstärkung Funktionsweise

A
  1. DCR1 (Dicer) erkennt virale dsRNA & schneidet
  2. RDE1 (primäres AGO) bindet siRNA & Target-mRNA
  3. RDE1 rekrutiert RRF1 (RNA-Pol)
  4. RRF1 synthetisiert siRNA upstream d. bereits vorhandenen siRNA (Primer-los, de novo)
  5. WAGO (sekundäres AGO) assoziiert mit neuen siRNAs
    - > höheres siRNA-Level, große Target-Sequenz abgedeckt

Molekularbiologie WiSe20/21 (9 decks)

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