Klonierungsstrategien Flashcards
Definition: Klone
genetisch veränderte Nachkommen
Aggregate/Kulturen identischer Zellen
Pflanzen/Tiere mit identischen Genen
Prinzip d. Gen-Klonierung
- Präparation GOI
- Präparation d. Vektors
- Rekombinieren v. Vektor & GOI
- Vermehren rekombinanter DNA
- Selektion auf Transformanden
- Identifizierung
- Charakterisierung, Sequenzierung, etc.
GOI-Präparation: Wie?
PCR
reverse Transkription
enzymatische Restriktion
Modifizierung
Vektor-Präparation: Wie?
enzymatische Restriktion
Modifizierungen
TA-Klonierung
Rekombinieren: Wie?
Ligase
Topoisomerase
PCR
Gateway-Techniken
Vermehren: Wie?
Infektion/Transfektion v. Wirtszellen (GVOs)
Identifizierung: Wie?
rekombinanter Vektor
Anwendungen für Klonierung
Subklonierung (Sequenzanalyse) Genbänke: vollständig, partiell, (c)DNA Proteinexpression (Funktionsanalyse) Mutagenese-Experimente Knock-in/-out/-down-Konstrukte Gentherapie gen. veränderte Planzen/Tiere
Plasmid-Vektoren: MSC, Restriktionsenzyme, ORI, Selektionsmarker, Backbone?
Multiple Cloning Site: Schnittstellen für Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme: verschiedene Schnittmöglichkeiten
ORI: spezifisch für Organismus, muss erhalten bleiben, manchmal 2 ORI wenn in Prokaryont gearbeitet wird
Selektionsmarker: erlaubt Selektion transferierter Bakterien, Antibiotika-Resistenz
Backbone: abgeleitet v. Bakterienplasmid
Definition: Copy-Number, Klonierungskapazität
Copy-Number: wie gut ist Vektor zu replizieren
Klonierungskapazität: wie viel DNA ist effizient zu Transferieren (bei kleinem Vektor besser)
Verscheidene Plasmid-Vektoren
F-Plasmid: bakteriell T-Plasmid: bakteriell, tumor-induzierend Lambda-Phage: dsDNA, linear Einzelstrangphage: ssDNA Viren-Derivat Hefe-Vektoren: lange DNA-Stücke, YACs
Plasmide für (Sub)Klonierung v. (c)DNA
pUC-Plasmid-Familie, pTOPO-Vektoren
Plasmide für Proteinexpression & -reinigung
pET-Plasmide (His-Tag-Reinigung), pGEX-Plasmide (GST-Pulldowns)
Welche Sequenzen haben Vektoren für Fusionsproteine?
Tag/Linker-Sequenz & Protein-Sequenz
Verschiedene Tags und welche Purifikation möglich ist
His-Tag: Säulenchromatografie Epitop-Tags: Immunaffinitäts-Chromatografie GST-Tag: Affinitätschromatografie HA-Tag: nicht-chromatografische Methoden GFP-Tag/Compund-Tag: Detektion
Was ist FLAG-Tag?
Phagen-Peptid aus AS: 1DYKDDDDK8 -> Erkennung durch Ak
Prinzip d. GST-Pulldowns
- Suspension aus Glutathion-Sepharose waschen & equilibrieren
- Zugabe d. Proteinlösung aus Bakterienlyse
- Proteine mit GST-Tag binden covalent an Sepharose -> Waschen
- Zugabe d. zu analysierenden Proteinlösung
- Protein bindet an GST-Protein -> Waschen
- Ablösen d. Protrin-Protein-GST-Komplexe: pH-Änderung, Glutathion-Inkubation, etc.
- Trennen d. Komplexes: Hitzedenaturierung, Separieren: SDS-PAGE, Analyse: Western Blot
Phagen-Vektoren: Wo Fremd-DNA? Verpackung? Genbänke?
Fremd-DNA in zentralem Teil ohne Vermehrungsverlust
Verpackung: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich
Cosmide: Besonderheiten? Packaging? Genbänke?
Plasmid-Elemente mit COS-Sites
rekombinante Klone sind Bakterien -> keine neuen Phagen
Packaging: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich
COS-Site: Funktion?
12 NT, GC-reich
3’ & 5’-Ende v. Phagen-DNA: Sticky Ends
bei Packen: Portal-Protein erkennt COS-Sites -> COS bis COS, dann Schnitt
bei zu wenig DNA -> Phage instabil
Bevorzugung lytischer Weg: Wie?
Gene für lysogenen Weg werden mit Target-Genen ersetzt
Imitieren v. DNA-Concatameren die bei Rolling-Circle-Replikation entstehen?
Annealing d. COS-Sites in vitro
Yeast Artificial Chromosome: Was? Packen? Stabilität?
artifizielles Chromosom: Telomer- & Centromer-Region
Packung: Einschläußen in Tochterzelle während Mitose
Kleine/Keine Inserts -> instabiles YAC, fällt v. Spindelapparat
Replikationsdefiziente Viren zum Einschleußen v. Fremd-DNA: Produktion? Infektion? DNA-Integration?
Produktion: in HEK293T-Zellen, Transfektion v. DNA & Verpackungs-Plasmiden
Infektion: ja, aber keine Gene für Kapsidproteine, Glycoproteine, Vermehrungs-Faktoren
Integration: dsDNA kan inn Wirts-cDNA integriert werden
3 Plasmide für replikationsdefiziente Viren & was codiert?
Transfer-Vektor: cDNA/shRNA, LTR
Packaging-Vektor: GAG, Pol, TAT
Envelope-Vektor: ENV
Faktoren für Vektor-Auswahl
Größe d. Inserts Größe d. Vektors Restriktionsstellen Anzahl an Kopien Klonierungseffizienz Screening-Fähigkeit
Restriktionsenzyme: Welche Enzyme? Erkennungsstelle? Überhänge? Variabilität?
meist bakterielle Restriktionsendonukleasen
Erkennungsstelle = Schnittstelle
Überhänge: Sticky oder Blunt Ends, Vektor & Target mit gleichem Enzym -> passend
Variabilität: Isoschizomere, Neoschizomere, Isocaudomere
8-Base-Cutter: Name & Sequenz
Not I: GC|GGCC|GC (Sticky Ends)
6-Base-Cutter: Name & Sequenz
Bam HI: G|GATC|C (Sticky Ends)
Bgl II: A|GATC|T (Sticky Ends)
Stu I: AGG|CCT (Blunt Ends)
Kpn I: GGTAC|C (Blunt Ends)
4-Base-Cutter: Name & Sequenz
Alu I: AG|CT (Blunt Ends)
Sau 3a/Mbol: |GATC| (Sticky Ends)
cDNA-Klonierung: Ablauf
- Restriktion d. Plasmid-/Phagenvektors
- Isolierung & Reinigung v. mRNA
- Reverse Transkriptase: cDNA aus mRNA
- Ligation v. cDNA & Vektor
- Transfektion/Transduktion d. Wirtsorganismen
- Wachstum unter Selektionsbedingungen
- Identifizierung & Vermehren v. Rakombinanten
- Analyse
Reverse Transkriptase: welche Enzyme in Komplex?
Stammt aus Retroviren
RNA-abhängige DNA-Pol, DNA-abhängige DNA-Pol, RNase H, Integrase
TA-Cloning (TOPO-TA): Funktionsweise?
Taq-Pol: 1NT Adenin-Rest an PCR-Produkt
TOPO-Vektoren: 1NT Thymin-Rest Überhang, kovalent gebundene Topoisomerase an 3’ & 5’-Ende
schwache Assoziation GOI & TOPO-Vektor -> kovalente Verknüpfung über Topoisomerase
Selektion auf Transformanden vs. auf GOI?
Wachsen d. bakterien auf Selektionsmedium: Selektion auf enthaltenen Vektor
Replica-Plating: Übertragen via Stempel auf 2. Selektionsmedium: Selektion auf GOI
Selektionsmedien & Art d. Selektion
Antibiotika-Medium: Einfach- & Doppelselektion
LacZ-Expression: Blau-Weiß-Selektion
lethale Gene: bei eukaryontischen Systemen
Mangel-Medium: bei Hefen
Herbizide: Pflanzentechnologie
PCR-Screening: Funktionsweise?
- Picken d. Bakterien (Zahnstocher) v. Master-Plate
- Zahnstocher in PCR-Mix tauchen
- Zahstocher in Kulturröhrchen mit Medium
- PCR & Produktanalyse auf Agarosegel
- Parallel Kulturröhrchen mit Medium inkubieren
- Isolierung d. Plasmide über Minipräp
Vektoren für Genbänke
Lambda-Phagen: Lambda-gt für Insertion, Lambda-EMBL für Replacement
Cosmide
YAC
BAC
