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Molekularbiologie WiSe20/21 > Klonierungsstrategien > Flashcards

Klonierungsstrategien Flashcards

1
Q

Definition: Klone

A

genetisch veränderte Nachkommen
Aggregate/Kulturen identischer Zellen
Pflanzen/Tiere mit identischen Genen

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Q

Prinzip d. Gen-Klonierung

A
  1. Präparation GOI
  2. Präparation d. Vektors
  3. Rekombinieren v. Vektor & GOI
  4. Vermehren rekombinanter DNA
  5. Selektion auf Transformanden
  6. Identifizierung
  7. Charakterisierung, Sequenzierung, etc.
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3
Q

GOI-Präparation: Wie?

A

PCR
reverse Transkription
enzymatische Restriktion
Modifizierung

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4
Q

Vektor-Präparation: Wie?

A

enzymatische Restriktion
Modifizierungen
TA-Klonierung

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5
Q

Rekombinieren: Wie?

A

Ligase
Topoisomerase
PCR
Gateway-Techniken

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6
Q

Vermehren: Wie?

A

Infektion/Transfektion v. Wirtszellen (GVOs)

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7
Q

Identifizierung: Wie?

A

rekombinanter Vektor

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8
Q

Anwendungen für Klonierung

A 
Subklonierung (Sequenzanalyse)
Genbänke: vollständig, partiell, (c)DNA
Proteinexpression (Funktionsanalyse)
Mutagenese-Experimente
Knock-in/-out/-down-Konstrukte
Gentherapie
gen. veränderte Planzen/Tiere
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9
Q

Plasmid-Vektoren: MSC, Restriktionsenzyme, ORI, Selektionsmarker, Backbone?

A

Multiple Cloning Site: Schnittstellen für Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme: verschiedene Schnittmöglichkeiten
ORI: spezifisch für Organismus, muss erhalten bleiben, manchmal 2 ORI wenn in Prokaryont gearbeitet wird
Selektionsmarker: erlaubt Selektion transferierter Bakterien, Antibiotika-Resistenz
Backbone: abgeleitet v. Bakterienplasmid

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10
Q

Definition: Copy-Number, Klonierungskapazität

A

Copy-Number: wie gut ist Vektor zu replizieren

Klonierungskapazität: wie viel DNA ist effizient zu Transferieren (bei kleinem Vektor besser)

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11
Q

Verscheidene Plasmid-Vektoren

A 
F-Plasmid: bakteriell
T-Plasmid: bakteriell, tumor-induzierend
Lambda-Phage: dsDNA, linear
Einzelstrangphage: ssDNA
Viren-Derivat
Hefe-Vektoren: lange DNA-Stücke, YACs
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12
Q

Plasmide für (Sub)Klonierung v. (c)DNA

A

pUC-Plasmid-Familie, pTOPO-Vektoren

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13
Q

Plasmide für Proteinexpression & -reinigung

A

pET-Plasmide (His-Tag-Reinigung), pGEX-Plasmide (GST-Pulldowns)

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14
Q

Welche Sequenzen haben Vektoren für Fusionsproteine?

A

Tag/Linker-Sequenz & Protein-Sequenz

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15
Q

Verschiedene Tags und welche Purifikation möglich ist

A 
His-Tag: Säulenchromatografie
Epitop-Tags: Immunaffinitäts-Chromatografie
GST-Tag: Affinitätschromatografie
HA-Tag: nicht-chromatografische Methoden
GFP-Tag/Compund-Tag: Detektion
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16
Q

Was ist FLAG-Tag?

A

Phagen-Peptid aus AS: 1DYKDDDDK8 -> Erkennung durch Ak

17
Q

Prinzip d. GST-Pulldowns

A
  1. Suspension aus Glutathion-Sepharose waschen & equilibrieren
  2. Zugabe d. Proteinlösung aus Bakterienlyse
  3. Proteine mit GST-Tag binden covalent an Sepharose -> Waschen
  4. Zugabe d. zu analysierenden Proteinlösung
  5. Protein bindet an GST-Protein -> Waschen
  6. Ablösen d. Protrin-Protein-GST-Komplexe: pH-Änderung, Glutathion-Inkubation, etc.
  7. Trennen d. Komplexes: Hitzedenaturierung, Separieren: SDS-PAGE, Analyse: Western Blot
18
Q

Phagen-Vektoren: Wo Fremd-DNA? Verpackung? Genbänke?

A

Fremd-DNA in zentralem Teil ohne Vermehrungsverlust
Verpackung: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich

19
Q

Cosmide: Besonderheiten? Packaging? Genbänke?

A

Plasmid-Elemente mit COS-Sites
rekombinante Klone sind Bakterien -> keine neuen Phagen
Packaging: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich

20
Q

COS-Site: Funktion?

A

12 NT, GC-reich
3’ & 5’-Ende v. Phagen-DNA: Sticky Ends
bei Packen: Portal-Protein erkennt COS-Sites -> COS bis COS, dann Schnitt
bei zu wenig DNA -> Phage instabil

21
Q

Bevorzugung lytischer Weg: Wie?

A

Gene für lysogenen Weg werden mit Target-Genen ersetzt

22
Q

Imitieren v. DNA-Concatameren die bei Rolling-Circle-Replikation entstehen?

A

Annealing d. COS-Sites in vitro

23
Q

Yeast Artificial Chromosome: Was? Packen? Stabilität?

A

artifizielles Chromosom: Telomer- & Centromer-Region
Packung: Einschläußen in Tochterzelle während Mitose
Kleine/Keine Inserts -> instabiles YAC, fällt v. Spindelapparat

24
Q

Replikationsdefiziente Viren zum Einschleußen v. Fremd-DNA: Produktion? Infektion? DNA-Integration?

A

Produktion: in HEK293T-Zellen, Transfektion v. DNA & Verpackungs-Plasmiden
Infektion: ja, aber keine Gene für Kapsidproteine, Glycoproteine, Vermehrungs-Faktoren
Integration: dsDNA kan inn Wirts-cDNA integriert werden

25
Q

3 Plasmide für replikationsdefiziente Viren & was codiert?

A

Transfer-Vektor: cDNA/shRNA, LTR
Packaging-Vektor: GAG, Pol, TAT
Envelope-Vektor: ENV

26
Q

Faktoren für Vektor-Auswahl

A 
Größe d. Inserts
Größe d. Vektors
Restriktionsstellen
Anzahl an Kopien
Klonierungseffizienz
Screening-Fähigkeit
27
Q

Restriktionsenzyme: Welche Enzyme? Erkennungsstelle? Überhänge? Variabilität?

A

meist bakterielle Restriktionsendonukleasen
Erkennungsstelle = Schnittstelle
Überhänge: Sticky oder Blunt Ends, Vektor & Target mit gleichem Enzym -> passend
Variabilität: Isoschizomere, Neoschizomere, Isocaudomere

28
Q

8-Base-Cutter: Name & Sequenz

A

Not I: GC|GGCC|GC (Sticky Ends)

29
Q

6-Base-Cutter: Name & Sequenz

A

Bam HI: G|GATC|C (Sticky Ends)
Bgl II: A|GATC|T (Sticky Ends)
Stu I: AGG|CCT (Blunt Ends)
Kpn I: GGTAC|C (Blunt Ends)

30
Q

4-Base-Cutter: Name & Sequenz

A

Alu I: AG|CT (Blunt Ends)

Sau 3a/Mbol: |GATC| (Sticky Ends)

31
Q

cDNA-Klonierung: Ablauf

A
  1. Restriktion d. Plasmid-/Phagenvektors
  2. Isolierung & Reinigung v. mRNA
  3. Reverse Transkriptase: cDNA aus mRNA
  4. Ligation v. cDNA & Vektor
  5. Transfektion/Transduktion d. Wirtsorganismen
  6. Wachstum unter Selektionsbedingungen
  7. Identifizierung & Vermehren v. Rakombinanten
  8. Analyse
32
Q

Reverse Transkriptase: welche Enzyme in Komplex?

A

Stammt aus Retroviren

RNA-abhängige DNA-Pol, DNA-abhängige DNA-Pol, RNase H, Integrase

33
Q

TA-Cloning (TOPO-TA): Funktionsweise?

A

Taq-Pol: 1NT Adenin-Rest an PCR-Produkt
TOPO-Vektoren: 1NT Thymin-Rest Überhang, kovalent gebundene Topoisomerase an 3’ & 5’-Ende
schwache Assoziation GOI & TOPO-Vektor -> kovalente Verknüpfung über Topoisomerase

34
Q

Selektion auf Transformanden vs. auf GOI?

A

Wachsen d. bakterien auf Selektionsmedium: Selektion auf enthaltenen Vektor
Replica-Plating: Übertragen via Stempel auf 2. Selektionsmedium: Selektion auf GOI

35
Q

Selektionsmedien & Art d. Selektion

A

Antibiotika-Medium: Einfach- & Doppelselektion
LacZ-Expression: Blau-Weiß-Selektion
lethale Gene: bei eukaryontischen Systemen
Mangel-Medium: bei Hefen
Herbizide: Pflanzentechnologie

36
Q

PCR-Screening: Funktionsweise?

A
  1. Picken d. Bakterien (Zahnstocher) v. Master-Plate
  2. Zahnstocher in PCR-Mix tauchen
  3. Zahstocher in Kulturröhrchen mit Medium
  4. PCR & Produktanalyse auf Agarosegel
  5. Parallel Kulturröhrchen mit Medium inkubieren
  6. Isolierung d. Plasmide über Minipräp
37
Q

Vektoren für Genbänke

A

Lambda-Phagen: Lambda-gt für Insertion, Lambda-EMBL für Replacement
Cosmide
YAC
BAC

Molekularbiologie WiSe20/21 (9 decks)

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