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Molekularbiologie WiSe20/21 > Gentherapie > Flashcards

Gentherapie Flashcards

1
Q

Gentherapie Definition: somatische & Keimzellen

A

Einbringen (manipulierter) Erbsubstanz in Organismus zu Therapiezwecken
somatische Zellen: keine Vererbung an Folgegeneration
Keimzellen: Vererbung an Folgegeneration (Keimbahn)

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Q

Transfektion Funktionsweise & Beispiele

A 
Chemisches Einbringen von DNA:
Calciumphosphat
Liposome
Gene Gun
Elektroporation
Magnetofektion
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3
Q

Transduktion Funktionsweise

A

Einbringen von DNA über gentechnisch veränderte Viren

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4
Q

Unterschied in vivo vs. ex vivo

A

in vivo: Erbgut wird direkt zu Organismus gegeben

ex vivo: Erbgut wird zu entnommenen Zellen gegeben & Zellen werden zu Organismus gegeben

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5
Q

Einbringverfahren mit guter Funktionsweise ex vivo

A 
cehm. Transfektion
Liposomen
Retroviren
Adenovieren
Herpesviren
adenoassoziierte Viren
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6
Q

Einbringverfahren mit guter Funktionsweise in vivo

A

Adenoviren

adenoassoziierte Viren

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7
Q

Vorteile von Viren als Vektoren: DNA-/RNA-/Retroviren

A

DNA: Genom bereits als DNA, großes Fassungsvermögen
RNA: z.T. breites Wirtszellspektrum
Retro: z.T. breites Wirtszellspektrum

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8
Q

Nachteile von Viren als Vektoren: DNA-/RNA-/Retroviren

A

DNA: hohe Wirtszellspezifität
RNA: nur transient in Zellen vorhanden, geringes Fassungsvermögen
Retro: Replikation nur in teilungsaktiven Zellen, tumorogen

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9
Q

Zu beachtende Aspekte bei Vektor-Konstruktion

A 
Klonierungskapazität: Menge DNA
Titer: Menge Viren
Zelltropismus: Art d. Zelle
Verpackungszellinie
Selektionsmarker: ex vivo
Stabilität: Ort d. DNA
Promotoraktivität
Toxizität
Immunogenität
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10
Q

Retrovirusvektoren (allgemein)

A 
diploide ssRNA, 7-10kB
Verpackungszellinie nötig: gag-pol & env
geringer Titer
max. 8kB Fremdsequenz
direkte gentechnische Manipulation
breites Wirtszellenspektrum
Integration in zufällige Wirtsgenom-Stelle
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11
Q

Genomabschnitt d. Retrovirus wichtig für gen. Manipulation

A

normales Genom: 5’LTR-Psi-gag-pro-pol-env-3’LTR
Vektorgenom: 5’LTR-Psi-Zielprotein-Antibiotikaresistenz-3’LTR
Psi wichtig zur Packung
Proteine d. Packung müssen v. Verpackungszellinie synthetisiert werden

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12
Q

Adenovirusvektoren (allgemein)

A

dsDNA, 36-48kB
Verpackungszellinie nötig: E1-Gen
hoher Titer
max. 35kB Fremdsequenz
gen. Manipulation über Rekombinationstechnik
hohe Wirtszellspezifität
keine Integration in Wirtsgenom (episomal)

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13
Q

Lebenszyklus eines Adenovirus

A
  1. Binden an Zellrezeptor: Integrin-Interaktion
  2. Internalisierung über Endosom
  3. pH-abhängige Freigabe & Kernimport
  4. episomale Replikation & Transkription d. mRNA
  5. Translation d. mRNA & Kernimport viraler Proteine
  6. Zusammenbau d. Virus in Zellkern
  7. Zellyse: Virus-Freigabe
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14
Q

Herstellung eines viralen Vektors über Shuttle-Vektor

A
  1. Zielgen (flankiert v. viraler Sequenz) in Shuttle Vektor
  2. Virus & Shuttle-vektor werden in Zelle eingebracht
  3. Co-Transfektion v. viralem Genom & Zielgen
  4. Rekombination & Selektion
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15
Q

Bacterial Artificial Chromosome (allgemein)

A

abgeleitet von F-Plasmid (E.coli)
bis 300kB Inserts
gen. Manipulation über Recombineering
nützlich für Knockout-/Knockin-Technologie bei Mäusen

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16
Q

An Recombineering beteiligte Systeme (Organismen?)

A

RecE/RecT aus Rac-Prophagen

redSystem aus Bakteriophage Lambda

17
Q

adenoassoziierte Virusvektoren (allgemein)

A

ssDNA, 37kB
Helferzellen nötig: E1A, E2A, E4 & VA-RNA
bis 4,7kB Fremdsequenz
Fremdsequenz zw. Inverted Terminal Repeats
ohne Helfervirus: Integration ins Wirtsgenom
ohne Rep-Gen: episomales Genom

18
Q

Serotypen d. adenoassoziierten Viren & Auswirkung

A

80-90% Erwachsene Seropositiv -> keine Krankheit
große Zahl an Serotypen
beeinflusst: Tropismus, Mutagenese, Selektion

19
Q

Steuern von Genexpression (gewebsspezifisch)

A

Über Promotorkontrolle: Promotor abhängig von TF in Gewebe

20
Q

Gewebsspezifische Promotoren: Leber/Muskel/Tumore

A 
Leber: Albuminpromotor
Muskel: Myosin-Light-Chain1-Promotor
Tumor: B16 Melanom -> Tyrosinkinase-Promotor
Brustkrebs -> DF3/MMC1-Promotor
Hepatome -> Afetoprotein-Promotor
21
Q

Anwendungsbereiche d. Gentherapie

A

gen. bedingte Erkrankungen
Onkologie
Infektionskrankheiten
-> schwere Erkrankung, ungünstige Prognose, keine andere Therapie

22
Q

Vorraussetzungen zur Anwendung d. Gentherapie

A

monogener Effekt: nur einzelnes Gen betroffen
rezessiver Defekt: Ersetzen d. Gens komplex
Gen liegt in klonierter Form vor

23
Q

Familiäre Hypercholesterinämie: Krankheitsbild & Ursache

A

hoher Cholesterinspiegel -> Arteriosklerose & Herzinfarkt

Grund: fehlender Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor -> gestörte Cholesterinaufnahme

24
Q

Faktor VIII-Mangel: Krankheitsbild & Ursache

A

Hämophilie

Grund: fehlende Protease in Blutgerinnungskaskade

25
Q

Mukoviszidose/cystische Fibrose: Krankheitsbild & Ursache

A

Ionenkanaldefet in Schleimhaut d. Lunge -> Verschleimung & kein Abhusten da kein H2O
Grund: defektes Cystic-Fibrosis-Transmembrane-Regulator-Protein

26
Q

ADA-SCID: Krankheitsbild & Ursache

A

dysfunktion von B-Zellen -> verminderte Immunantwort

Grund: fehlende Adenosin-Desaminase -> Akkumulation v. Adenosin & 2-Deoxyadenosin (tox.)

27
Q

Möglichkeiten Virusvektoren einzubringen

A

Injektion (systemische Gabe)
intraoperative Applikation (lokale Gabe)
Inhalation

28
Q

Risiko der Verwendung viraler Vektoren

A

Immunantwort gegen Vektor

bei Adenoviren: Komplementsystem -> Blutgerinnung & Organversagen

29
Q

CAR-T-Zellen: Was, Nutzung?

A

Gentherapie bei Tumoren: spezifität eines Ak & zytotoxische Aktivität einer T-Zelle
synthetischer Ag-Rezeptor aus Ak-Domäne
Rezeptor gekoppelt an signalübertragende Edodomäne (aus T-Zellen)

30
Q

Problem von CAR-T-Zellen & Lösung

A

Problem: nicht langzeitaktiv & ineffiziente Lyse
Grund: keine co-stimulatorischen Moleküle an TCRs
Lösung: Einbau spezifisches Ag d. Epstein-Barr-Virus, Virus in fast jedem Körper vorhanden -> kontinuierliche Stimulation d. CAR-T-Zellen durch Immunsystem

31
Q

Schmerztherapie über Gentherapie Beispiele & Gabe

A

ppßEP: Prepro-ß-Endorphin: schmerzstillend
IL-10: Interleukin 10, entzündungshemmend
einmalige Injektion über Lumbalpunktion

32
Q

Alternativen zu Virusvektoren

A

CRISPR/Cas-System:
kein Gentransfervektor
schneiden d. Zielsequenz über artifizielle guideRNA in Cas9

Molekularbiologie WiSe20/21 (9 decks)

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