Gentherapie Flashcards
Gentherapie Definition: somatische & Keimzellen
Einbringen (manipulierter) Erbsubstanz in Organismus zu Therapiezwecken
somatische Zellen: keine Vererbung an Folgegeneration
Keimzellen: Vererbung an Folgegeneration (Keimbahn)
Transfektion Funktionsweise & Beispiele
Chemisches Einbringen von DNA: Calciumphosphat Liposome Gene Gun Elektroporation Magnetofektion
Transduktion Funktionsweise
Einbringen von DNA über gentechnisch veränderte Viren
Unterschied in vivo vs. ex vivo
in vivo: Erbgut wird direkt zu Organismus gegeben
ex vivo: Erbgut wird zu entnommenen Zellen gegeben & Zellen werden zu Organismus gegeben
Einbringverfahren mit guter Funktionsweise ex vivo
cehm. Transfektion Liposomen Retroviren Adenovieren Herpesviren adenoassoziierte Viren
Einbringverfahren mit guter Funktionsweise in vivo
Adenoviren
adenoassoziierte Viren
Vorteile von Viren als Vektoren: DNA-/RNA-/Retroviren
DNA: Genom bereits als DNA, großes Fassungsvermögen
RNA: z.T. breites Wirtszellspektrum
Retro: z.T. breites Wirtszellspektrum
Nachteile von Viren als Vektoren: DNA-/RNA-/Retroviren
DNA: hohe Wirtszellspezifität
RNA: nur transient in Zellen vorhanden, geringes Fassungsvermögen
Retro: Replikation nur in teilungsaktiven Zellen, tumorogen
Zu beachtende Aspekte bei Vektor-Konstruktion
Klonierungskapazität: Menge DNA Titer: Menge Viren Zelltropismus: Art d. Zelle Verpackungszellinie Selektionsmarker: ex vivo Stabilität: Ort d. DNA Promotoraktivität Toxizität Immunogenität
Retrovirusvektoren (allgemein)
diploide ssRNA, 7-10kB Verpackungszellinie nötig: gag-pol & env geringer Titer max. 8kB Fremdsequenz direkte gentechnische Manipulation breites Wirtszellenspektrum Integration in zufällige Wirtsgenom-Stelle
Genomabschnitt d. Retrovirus wichtig für gen. Manipulation
normales Genom: 5’LTR-Psi-gag-pro-pol-env-3’LTR
Vektorgenom: 5’LTR-Psi-Zielprotein-Antibiotikaresistenz-3’LTR
Psi wichtig zur Packung
Proteine d. Packung müssen v. Verpackungszellinie synthetisiert werden
Adenovirusvektoren (allgemein)
dsDNA, 36-48kB
Verpackungszellinie nötig: E1-Gen
hoher Titer
max. 35kB Fremdsequenz
gen. Manipulation über Rekombinationstechnik
hohe Wirtszellspezifität
keine Integration in Wirtsgenom (episomal)
Lebenszyklus eines Adenovirus
- Binden an Zellrezeptor: Integrin-Interaktion
- Internalisierung über Endosom
- pH-abhängige Freigabe & Kernimport
- episomale Replikation & Transkription d. mRNA
- Translation d. mRNA & Kernimport viraler Proteine
- Zusammenbau d. Virus in Zellkern
- Zellyse: Virus-Freigabe
Herstellung eines viralen Vektors über Shuttle-Vektor
- Zielgen (flankiert v. viraler Sequenz) in Shuttle Vektor
- Virus & Shuttle-vektor werden in Zelle eingebracht
- Co-Transfektion v. viralem Genom & Zielgen
- Rekombination & Selektion
Bacterial Artificial Chromosome (allgemein)
abgeleitet von F-Plasmid (E.coli)
bis 300kB Inserts
gen. Manipulation über Recombineering
nützlich für Knockout-/Knockin-Technologie bei Mäusen
An Recombineering beteiligte Systeme (Organismen?)
RecE/RecT aus Rac-Prophagen
redSystem aus Bakteriophage Lambda
adenoassoziierte Virusvektoren (allgemein)
ssDNA, 37kB
Helferzellen nötig: E1A, E2A, E4 & VA-RNA
bis 4,7kB Fremdsequenz
Fremdsequenz zw. Inverted Terminal Repeats
ohne Helfervirus: Integration ins Wirtsgenom
ohne Rep-Gen: episomales Genom
Serotypen d. adenoassoziierten Viren & Auswirkung
80-90% Erwachsene Seropositiv -> keine Krankheit
große Zahl an Serotypen
beeinflusst: Tropismus, Mutagenese, Selektion
Steuern von Genexpression (gewebsspezifisch)
Über Promotorkontrolle: Promotor abhängig von TF in Gewebe
Gewebsspezifische Promotoren: Leber/Muskel/Tumore
Leber: Albuminpromotor Muskel: Myosin-Light-Chain1-Promotor Tumor: B16 Melanom -> Tyrosinkinase-Promotor Brustkrebs -> DF3/MMC1-Promotor Hepatome -> Afetoprotein-Promotor
Anwendungsbereiche d. Gentherapie
gen. bedingte Erkrankungen
Onkologie
Infektionskrankheiten
-> schwere Erkrankung, ungünstige Prognose, keine andere Therapie
Vorraussetzungen zur Anwendung d. Gentherapie
monogener Effekt: nur einzelnes Gen betroffen
rezessiver Defekt: Ersetzen d. Gens komplex
Gen liegt in klonierter Form vor
Familiäre Hypercholesterinämie: Krankheitsbild & Ursache
hoher Cholesterinspiegel -> Arteriosklerose & Herzinfarkt
Grund: fehlender Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor -> gestörte Cholesterinaufnahme
Faktor VIII-Mangel: Krankheitsbild & Ursache
Hämophilie
Grund: fehlende Protease in Blutgerinnungskaskade
