Regulace genové exprese Flashcards
V jaké fázi je regulace genové exprese nejčastější?
- v iniciaci transkripce (není spotřeba ATP, dá se vypnout a znovu pustit od stejného místa)
- v každé buňce je jiná regulace, bo každá buňka vytváří jiné proteiny…
- na regulaci se podílejí extracelulární signály
Rozpoznání DNA double helixu regulačními proteiny
- regulační proteiny mohou mít DNA vazebné domény
- musí rozpoznat DNA a promotorové oblasti pro navázání
- Nerozpoznávají primární sekvenci, ale povrch double helixu (bez přerušení H vazeb = bez rozplétání) -> primární struktura se musí promítat na povrchu double helixu
- většinou se RP vážou do velkého žlábku (různé chemické vzorce bází)
- Dále se rozpoznává další geometrie double helixu - DNA má lokální nepravidelnosti -> úhel cca 36 stupňů
- RP rozpoznávají sekvence okolo 20 nukleotidů
- kontakt mezi nimi: H můstky, iontovými vazbami, hydrofóbními interakcemi
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - druhy
1.HELIX-TURN-HELIX MOTIV
2.ZINC FINGER MOTIV
3.BETA-STRUKTURA
4.LEUCINE-ZIPPER MOTIV
5. HELIX-LOOP-HELIX MOTIV
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - Helix-turn-helix motiv
HELIX-TURN-HELIX MOTIV
- Prokaryota i Eukaryota
- 2 alpha-helixy spojené krátkým řetězcem AMK, mezi nimi fixní úhel
- C-koncový alpha-helix:
-> váže se do velkého žlábku
-> rozpoznává specifickou nukleotidovou sekvenci
- N-koncový alpha-helix:
-> má na starost další interakce (např. s GTF)
- můžou být i další domény, můžou být součásti většího proteinu
- často se vážou jako dimery
- často se vážou na palindromy
- např. Tryptofan represor, lambda cro, lambda represor fragment
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - Zinc finger motiv
- atomy Zn
1.ALPHA-HELIX a BETA-STRUKTURA: - spojené 1 zinkem
- alpha-helix se váže do velkého žlábku
- často vazba na repetitivní sekvence
2.DVA ALPHA-HELIXY - spojené 2 zinky
- tvoří dimery, jeden alpha-helix zase vázaný do big žlábku
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - Beta-struktura
- tvoří dimery
- vazba do big žlábku
Bakteriální MET REPRESOR PROTEIN: - regulace syntézy methioninu
- využívá kofaktor = S-adenyl methionin
- kofaktor moduluje uspořádání struktury -> pevná vazba s DNA
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - Leucine-zipper motiv
- 2 alpha-helixy spojené hydrofobními interakcemi (často hodně leucinu)
- Y struktura
- část se váže do big žlábku
- tvoří dimery - Heterodimery (jiný protein), homodimery
- Regulují 3 oblasti - 1. protein s 2. proteinem, 2. protein s 1. proteinem, pak 1. a 2. dohromady)
DNA-vazebné motivy na regulačních proteinech - Helix-loop-helix motiv
- 2 alpha-helixy spojené flexibilní smyčkou
- C-konec do DNA
- možné dimery - homo- i hetero-
- Heterodimer - když chybí/je neúplný C-konec -> INAKTIVAČNÍ PROTEIN (vyvazuje aktivní regulační protein)
- ,,Když ne já, tak se neváže nikdo’’
- Heterodimerizace může vést k inhibici jednoho z partnerů
Jaká je predikce DNA sekvence rozpoznávané regulačními motivy v rámci RP?
- neplatí, že daná AMK musí interagovat s daným párem v DNA
- predikce je velmi obtížná
- důležitý kontext DNA
Regulace iniciace transkripce
NEGATIVNÍ REGULACE:
- Regulační protein po nasednutí na promotor zabrání transkripci = funguje jako represor
- zabrání navázání polymerázy
- vazba ligandu -> RP se neváže
- najde represor -> naváže se na něj -> represor se odváže v promotoru -> start transkripce
POZITIVNÍ REGULACE:
- Regulační protein po nasednutí na promotor podporuje transkripci = funguje jako aktivátor
- pomáhá navázat další TFs a polymerázu
- může se navázat pouze s ligandem
Příklady regulace transkripce u prokaryot - E. Coli - Trp represor
- Regulační proteiny ovlivňují přímo navázání polymerázy (nejsou tam meziprodukty)
- Regulace tryptofanovým represorem
- polycistronní transkripce (kóduje víc proteinů)
- jedna regulační oblast reguluje vznik polycistronní mRNA
- Málo tryptofanu v buňce -> zapnutí biosyntézy Trp -> musí být aktivován operon
- Trp represor = Helix-turn-helix motiv
- Trp represor poznává operátor (oblast v promotoru) -> může se tam navázat pouze s 2 Trp! -> nasedne -> transkripce vypnutá
- Málo Trp -> Trp zmizí z Trp represoru -> transkripce zapnutá
- Trp = inhibiční ligand
Příklady regulace transkripce u prokaryot - E. Coli - regulace Lac operonu
- kombinovaná regulace exprese genu - aktivátor a represor
- Laktóza je -> nasedne na represor -> uvolní se z operátoru (na promotoru) -> exprese aktivovaná
- Málo laktózy -> laktóza se neváže na represor -> represor sedí na operátoru -> exprese vypnutá
- CAP protein = Catabolite activator protein
- glukóza je preferovaný zdroj živin
- CAP protein aktivuje geny pro využívání jiného zdroje uhlíku
- Málo glukózy -> zvýší se produkce cAMP -> váže se na CAP protein -> CAP se váže do vazebného místa -> aktivace exprese
- !!Pro aktivaci transkripce je potřeba nedostatek glukózy (represor se neváže) a dostatek laktóza (CAP se váže)!!
Iniciace transkripce u eukaryota, represorové proteiny - např. tipy
- RNA polymeráza potřebuje nejdřív navázané GTFs - ty regulují právě regulační proteiny
- regulační proteiny jsou daleko od promotoru
- Aktivátorové proteiny - DNA vazebná doména + Aktivační doména (interakce s GTFs)
- např. kyselý aktivátor
- Gen, TATA box, vzdálené RPs -> smyčka -> kontakt GTFs s RPs
- Řada proteinů může být represory i aktivátory najednou
REPRESOROVÉ PROTEINY: - negativně ovlivňují expresi
- Eukaryota i prokaryota
- Kompetice o vazebnou sekvenci DNA - vazebná místa blízko sebe, mohou se překrývat, aktivátor se tam kvůli navázanému represoru nevejde
- Represor váže aktivátor - kiss
- Přímá interakce represoru s GTF - eukaryota, represor tak blokuje navázání aktivátoru
- Tvorba heterodimeru - jeden z interagujících partnerů může fungovat jako represor
Regulace oblastí genomu - Regulační role methylace DNA
- = Methylace cytosinu -> 5-methylcytosin
- neovlivňuje párování bází, to je furt stejné
- Methylované místo = neaktivní pro transkripci
UDRŽOVACÍ METHYLÁZA: - methylace během replikace nového vlákna podle starého
METHYLACE DE NOVO: - Buňka se rozhodne, že chce nějaké geny vypnout
- vypnutí transkripce genů -> nejdřív se odstraní aktivační regulační proteiny -> vypne se transkripce, ale stále se prokluzuje -> de novo methylace
- eliminace regulačních proteinů -> de novo methylace -> vazba proteinů, které poznávají methyl cytosin -> vazba proteinů ovlivňujících strukturu chromatinu a vazbu histonů -> transkripce vypnutá úplně
- ## Různé modifikace histonů - Acetylace, methylace, fosforylace, deacetylace, ubiquitinace
Regulace oblastí genomu - Struktura chromatinu
- heterochromatin (telomery, nedostupný pro aktivátory), euchromatin
Regulace oblastí genomu - Struktura chromatinu
- heterochromatin (telomery, nedostupný pro aktivátory), euchromatin
- HISTON DEACETYLÁZY:
- rozpoznání a vazba ne specifické represory
- N-konce deacetylují
- HISTON ACETYLÁZY:
- rozpoznání a vazba na aktivátory
Regulace oblastí genomu - Umlčování genomu
- např. nižší eukaryota (kvasinky):
- tvorba kondensovaného heterochromatinu
- u kvasinek: telomery, lokusy: MAT, HML, HMR
-> MAT - párovací typ A nebo alpha
-> Pouze informace v lokusu jsou transkribované -> podle toho se buňka chová jako A nebo alpha
-> HML - geny pro A
-> HMR - geny pro alpha
-> HML a HMR umlčené
SIR geny: - = Silent information regulator
- Sir1p, Sir2p, Sir3, Sir4p
- Sir2p - u eukaryot histon deacetyláza -> efektivní umlčování
- Sir2p, Sir3p, Sir4p - v telomerách
Změny exprese provázené změnami DNA genomu (reverzibilní, mohou do potomků) - Určení párovacího typu kvasinek
- regulace MAT z HML a HMR
- 3 kazety (1 aktivní) v MAT lokusu
- aktivní kazeta reguluje změnu exprese velkého počtu genů na různých místech -> určuje buněčný typ (a, alfa, obojí)
- specifické geny - aSG, alfa SG, hSG
- kazety se dají měnit
- enzym HO ENDONUKLEÁZA
Změny exprese provázené změnami DNA genomu (reverzibilní, mohou do potomků) - Bakterie Salmonella
- genomové změny pomáhají uniknout před imunitou
- geny H1, H2 - kódují expresi povrchového proteinu flagelinu
- Promotor otočený správně k operonu s H2 polohou -> aktivace tvorby H2 + inhibice H1
- naopak po M-S rekombinaci
Posttranskripční regulace - 1. Atenuace - Trp-operon
- u Prokaryota
- transkripce se dá předčasně ukončit, pokud její produkt už nepotřebujeme
- transkripce Trp:
-> Hodně Trp -> hodně tRNA pro Trp -> ukončení transkripce
-> Málo Trp - -> Málo i tRNA pro Trp -> transkripce je dokončena
Posttranskripční regulace - 1. Atenuace - Riboswitch
- sekundární struktury na 5’ koncích vznikajících transkriptů
- další exprese nebo terminace
- např. Reakce na guanin:
-> Málo G -> RNA pol. se neodpojí a jede dál
-> Hodně G-> Guanin se váže na riboswitch -> změna struktury -> vznik terminální vlásenky -> syntéza se zastaví
Posttranskripční regulace - 1. Atenuace - Antiterminace rho-závislé terminace
- za daných okolností mohou vznikat další transkript
- blokuje funkci rho faktoru -> neukončení transkripce
- Nus = N utilisation substances, NusA, NusE, NusB, NusG
Posttranskripční regulace - 2. Alternativní sestřih a polyA
- úpravy mRNA
- regulace vyštěpení intronu
Dlouhý transkript: - připojení PolyA sekvence na 3’ konec
- zachovaná sekvence intronu
- štěpí se intron (v něm i 1. STOP kodon -> použije se 2. STOP kodon -> translace -> peptid na membráně buňky
Krátký transkript: - Chybí akceptorové místo intronu (končí před ním, bo 1. STOP kodon)
- intron tak není odstraněn
- peptid jde ven mimo buňku
Posttranskripční regulace - 3. Transport z jádra do cytosolu
- kontrola kvality RNA (čepička, polyA, sestřih)
- do cytoplasmy, zbytek v jádře degradován
- transport přes jaderný pór - mRNA musí být upravená, aby mohla projít
Posttranskripční regulace - 4. Lokalizace mRNA ve specifických místech cytoplasmy
- většinou jde mRNA v cytosolu hned na translaci
- může se nejdřív dostat do daného místa a pak se translatovat
- potřebné signály jsou v UTR oblasti (untranslated region)
- např. transport některých mRNA v různých místech v buňce v embryu Drosophily -> proteinový gradient
Posttranskripční regulace - 6. RNA editing
- v mRNA dochází k přeměně nukleotidových sekvencí RNA transkriptů
- spíše u evolučně starých organismů
MITOCHONDRIE TRYPANOZOMY: - inzerce/delece 1 či více U do přesný míst -> modifikace produktu -> jiný protein
- gRNA = určují, jaká bude modifikace cílových míst, polyU ocásek
- Uridyl transferáza - doplnění chybějících U na základě gRNA předlohy
MITOCHONDRIE ROSTLIN: - změna C na U díky gRNA
- nejsou inzerce/delece, prostě se někde vserou
SAVČÍ APOLIPOPROTEIN B: - 2 varianty proteinu
- jaterní varianta Apo-B100 = kodon CAA
- střevní varianta Apo-B48 = editací změna CAA na UAA -> STOP kodon
- specifické enzymy ADAR (adenosin deaminase acting on RNA) - ADAR2 editace v mozku (delecí ADAR2 u myši vznikla epilepsie)
Posttranskripční regulace - 7. Stabilita mRNA
- více komplikovaný organismus -> delší životnost a variabilita mRNA
- primitivnější organismus -> malá životnost mRNA -> rychlá reakce na prostředí
- před PolyA ocáskem je netranslatovaná oblast (UTR)
- Transport do cytosolu -> zkracování polyA ocásku -> rychlá degradace
- Odpověď na mimobuněčný signál - např. steroidní hormony -> zvyšují stabilitu některých mRNA
- Kontrola mRNA kódující histony - polyA nahrazeno vlásenkou -> degradace
Posttranskripční regulace - 8. Kontrola translace - Prokaryota
- Prokaryota
- Př. 1: vlásenka na 5’ netranslatovaném konci mRNA -> na vlásenku se připojí specifický protein, čouhá i do S-D sekvence -> blokuje ji -> ribosom se nenaváže
- Př. 2: na 5’ konci sek. struktura, o osudu translace této mRNA rozhoduje kofaktor -> pokud navázaný represor -> ribosom se nenaváže na S-D sekvenci
Shine-Dalgarno sekvence
- sekvence důležitá pro iniciaci translace u prokaryot
- důležitá pro vazbu ribozomu
Posttranskripční regulace - 8. Kontrola translace - Eukaryota (Fero Ferovič)
- Eukaryota
- 5’ konec mRNA, není S-D sekvence
- jde o blokaci možnosti vstupu ribosomu a rozpoznání 5’ konce
Př. 1: Homeostáza Fe: - regulace ferritinu, který vyvazuje Fe a chrání buňky před toxicitou
- na 5’ konci ferritinové mRNA je vlásenka -> rozpoznaná cytosolickou akonitázou (schopná vázat Fe)
- Málo Fe: akonitáza bez Fe na vlásence (bo má hlad) -> blokace translace, netvoří se ferritin, nesnižuje se hladina Fe
- Hodně Fe: Fe se váže na akonitázu -> změna konformace, akonitáza jde z vlásenky pryč -> mRNA není blokovaná -> translace možná, ferritin je vytvářen a Fe hladina se snižuje
Př. 2: eIF-2: - normálně - komplex s GTP
Posttranskripční regulace - 10. Regulace malými nekódujícími RNA transkripty - MicroRNA regulace
- Eukaryota only
- prekurzory, syntéza RNA pol. II, taky mají polyA a 5mg čepičkou
- štěpení miRNA pomocí RISC komplexu (RNA induced silencing complex) - pomoc při párování s cílovou RNA
- 1 miRNA může regulovat více mRNA
- 1 mRNA může být regulována více miRNA
- miRNA zabírá méně prostoru v genomu, je úspornější než proteiny
- Proces miRNA regulace - syntéza miRNA s polyA a 5mg čepičkou -> sestřih -> export skrz jaderný pór -> další sestřih enzymem Dicer -> vazba RISC komplexu -> vznik krátkého ss úseku miRNA s navázaným RISC
U ROSTLIN: 🌱 - pevná vazba mezi miRNA a mRNA
- rozpoznání cílové mRNA a její štěpení RISC komplexem
- může být odstřihnutí polyA -> degradace mRNA
- spotřeba ATP na uvolnění
U ŽIVOČICHŮ:🦍 - slabší vazba
- může se vázat do UTR oblasti mRNA -> může být destabilizace nebo snížení efektivity translace
- P-BODIES: uskladnění mRNA s navázanou miRNA -> pak uvolnění pro translaci/degradaci
-> časté místo pro degradaci jakékoliv mRNA
Posttranskripční regulace - 10. Regulace malými nekódujícími RNA transkripty - RNA interference
= RNAi
- u všech
- často degradace i cizí RNA (viry)
- hodně stejných proteinů jako u miRNA regulace
- dsRNA -> spojení s Dicer -> dsRNA na siRNA (small interfering RNA, krátké ds úseky) -> naváže se RISC komplex -> odstraní se jedno vlákno -> ss siRNA s RISC komplexem -> degradace
- jako miRNA, i siRNA se umí odvázat se degradovat více RNA
- může se takhle i vypnout syntéza cílové RNA:
-> siRNA se váže s RITS (RNA induced transcriptional silencing) -> degradace na ss siRNA -> navede komplex na cílový transkript
Posttranskripční regulace - 11. Stabilita proteinů - Proteasom
= Ubiquitin-dependentní proteolytická dráha, zahrnuje proteasomy
1. LIKVIDACE ŠPATNĚ SBALENÝCH PROTEINŮ
PROTEASOM:
= proteinové komplexy v cytoplazmě a jádře
- 26S = 20S + 19S
- centrální core - v něm likvidace proteinů
- čepičky - rozpoznání proteinů
- degradace ubiquitinem
- proteiny pro degradaci nemusí mít značku
- Nový vznikající protein, který není dokončen, má translační aparát a chaperony, aby nebyl degradován
- E1 a E2 = ubiquitin označující enzymy
- E3 = ubiquitin ligása (říká, že má být označená ubiquitinem)
- Ubiquitin interaguje s E1 + ATP -> komplex E1 a ubiquitin -> vazba E1 na E2 -> E2 vazba s E3
2.AKTIVACE UBIQUITIN LIGÁSY
- aby začala rozpoznávat substrát
- Fosforylace ubq ligázy protein kinázou, vazba malého ligandu a změna struktury ligázy NEBO vazba proteinové podjednotky pro změnu konformace
Posttranskripční regulace - 11. Stabilita proteinů - Proteasom
= Ubiquitin-dependentní proteolytická dráha, zahrnuje proteasomy
1. LIKVIDACE ŠPATNĚ SBALENÝCH PROTEINŮ
PROTEASOM:
= proteinové komplexy v cytoplazmě a jádře
- 26S = 20S + 19S
- centrální core - v něm likvidace proteinů
- čepičky - rozpoznání proteinů
- degradace ubiquitinem
- proteiny pro degradaci nemusí mít značku
- Nový vznikající protein, který není dokončen, má translační aparát a chaperony, aby nebyl degradován
- E1 a E2 = ubiquitin označující enzymy
- E3 = ubiquitin ligása (říká, že má být označená ubiquitinem)
- Ubiquitin interaguje s E1 + ATP -> komplex E1 a ubiquitin -> vazba E1 na E2 -> E2 vazba s E3
2.AKTIVACE UBIQUITIN LIGÁSY
- aby začala rozpoznávat substrát
- Fosforylace ubq ligázy protein kinázou, vazba malého ligandu a změna struktury ligázy NEBO vazba proteinové podjednotky pro změnu konformace
3.AKTIVACE DEGRADAČNÍHO SIGNÁLU PROTEINU
- fosforylace specifickou kinázou, odstranění proteinu blokující degradační signál NEBO vytvoření nestabilního N-konce
Posttranskripční regulace - 11. Stabilita proteinu - Poločas proteinů
- N-koncové pravidlo: AMK na N-konci proteinu může ovlivňovat jeho stabilitu
EUKARYOTA: - Stabilizující AMK - Met, Gly, Pro, Thr, Val, Ala
- I druhá AMK je často stabilizující
- Destabilizující AMK - Arg, Asn, Gln, většinou nejsou na koncích cytoplasmatických proteinů, ale často na N-konci proteinů v jiných organelách (když se dostane omylem do cytoplazmy -> degradace, nemá tam co dělat)
- N-koncové AMK mohou být acetylací chráněné před degradací
