Posttranslační modifikace a kontrola kvality proteinů v ER

Question 1

Co probíhá v ER či GA, ERAD dráha a degradace proteinu

Answer 1

• ER - tvorba S-S můstků, správný folding, kontrola kvality a degradace proteinů, N-glykosylace
• GA - O-glykosylace, specifické proteolytické štěpení (odstranění signální sekvence, někdy už v ER)
• ER, GA, sekreční váčky - sestavení multimerních komplexů
  ERAD dráha:
• '’ER associated degradation’’
• rozpoznává špatně sbalené nebo poškozené proteiny
• Protein se transportuje zpět do cytosolu -> degradace v proteasomu
• Polyubiquitinace nastává při průchodu membránou ER do cytosolu (skrz póry, kanály)
• degradace na 1-2 hodiny

Question 2

Tvorba disulfidických můstků, glutathion

Answer 2

• = kovalentní vazba mezi dvěma SH skupinami dvou Cys
• Stabilizace terciální, příp. kvarterní struktury proteinů
• Cystein obsahuje thiolové skupiy (-SH) -> oxidativním propojením vzniká S-S můstek
• tvorba JEN v oxidativním prostředí - ER, mezimembránový prostor mitochondrií
• K tvorbě S-S můstků NESMÍ dojít v cytoplasmě, bo je tam redukční prostředí
  GLUTATHION (GSH)
• určuje, jaké bude oxidativně-redukční prostředí v daném kompartmentu
• Malá molekula, tripeptid, vysoká koncentrace v buňce
• redukovaná forma 50:1
• může přecházet mezi redukovanou a oxidovanou formou
• Oxidanty nejdřív oxidují GSH než S-S můstky
• poměr 50:1 udržuje GLUTATHION REDUKTÁZA, bere elektrony z NADPH (vznik NADP+)
• PROTEIN DISULFID IZOMERÁZA (PDI) - enzym, výměny S-S můstků

Question 3

Správný folding proteinů

Answer 3

• pomocné proteiny - PDI, chaperon Hsc70, lektiny
• Chaperony (zároveň lektiny) v ER - rozpoznají N-glykosylované proteiny. Calnexin, Calreticullin
• Např. Hemaglutinin - povrchový protein, tvorba v ER
• Peptidyl prolyl izomerázy - pomáhá zaujmout proteinům nativní konformaci (cis nebo trans)

Question 4

Správný folding - Unfolded protein response + Transport proteinů s funkcí v ER

Answer 4

• = UPR
• mechanismy detekce špatně sbalených proteinů
• celá Eukaryota
• Detekce ER stresu -> zvýšení transkripce genů kódující chaperony a ERAD
• IRE1 - klíčový protein, senzor stresu, efektor, přítomný v na vnitřní membráně jaderného póru
• Interakce s chaperonem Hsc70 -> brání dimerizaci IRE1
• doména IRE1, RNAáza
• RNAáza - jediný substrát - mRNA genu HAC1
  TRANSPORT PROTEINŮ V FUNKCÍ V ER:
• Transport do Cis GA, neselektivní
• jde o ER rezidentní proteiny, vrací se zpět do ER
• musí mít specifickou sekvenci KDEL, v cis GA je KDEL receptor

Question 5

O-glykosylace

Answer 5

• jednodušší
• připojuje po jednom krátké cukerné zbytky - pomocí GLYKOSYLTRANSFERÁZY
• v GA, posttranslačně
• Oligosacharidy jsou připojeny k hydroxylové skupině Ser/Tyr (popř. hydroylysinu v kolagenu)
• SAVCI: první připojený cukr - N-acetalgalaktosamin
• Málo vitaminu C pro hydroxylysin -> špatná O-glykosylace -> špatná tvorba kolagenu (kurděje)
• To který Ser nebo Tyr bude glykosylován se určí asi podle přístupnosti pro enzym
• Glykosyltransferázy - membránové proteiny GA, specifické (donor/akceptor…)
• Substrát:
  -> aktivované cukry
  -> připojované k nukleosid mono-/di- fosfátu
  -> transport do ER z cytosolu
  -> vznik v cytosolu z NTP a cukr-fosfátu specifickými enzymy
  -> cesta do ER a GA přes specifické antiporterové proteiny (dovnitř jde cukr, ven jde zbytek nukleosidu)

Question 6

N-glykosylace

Answer 6

• začíná v drsném ER
• připojení rozvětveného oligosacharidu z přenašeče DOLICHOL
• Kotranslačně hned po vylezení z translokonu
• DOLICHOL - kotva v membráně, dochází zde k syntéze prekurzorového oligosacharidu
• Dolichol + prekurzorový oligosacharid = DOLICHOL PYROFOSFORYL OLIGOSACHARID
• Oligosacharid je v lumen ER připraven jako substrát pro enzym oligosacharidprotein transferázu (OST)
  OLIGOSACHARIDPROTEIN TRANSFERÁZA:
• OST je součástí translokonu
• N-glykosylace je okamžitě po výstupu z translokonu
• 3 podjednotky, 1., 2. obsahují RIBOPHORINY
  RIBOPHORINY:
• integrální membránové proteiny ER
• drží v membráně OST a reagují s ribozomem -> přibližují ribozom k aktivnímu translokonu
• Přenos zbytek polypeptidu z dolicholu na Asn, pokud po něm následuje Ser nebo Tyyr a mezi nimi je 1 random AMK
• N-glykosylová značka je dále upravována v GA, je rozpoznána chaperony CALNEXINEM a CALRETICULINEM
• glykosylované proteiny jsou o trochu víc stabilnější, někdy je N-glykosylace nutná pro správný folding
  UGGT:
• = specifická glukosyltransferáza
• rozpoznává špatně sbalené proteiny
• na špatný protein přidá značku a pošle zpět do ER na sbalení
• pokud se protein nedá sbalit -> označí se jinou značkou -> rozpozná jej ERAD dráha, proteiny tedy mají určitý časovač na sbalení

Question 7

Směřování enzymů do lysozomů

Answer 7

• může v tom pomoct N-glykosylická značka
• NEZBYTNÉ je připojení MANOSY-6-FOSFÁTOVÉ ZNAČKY -> připojení na N-glykosylovaný polysacharid -> rozpoznání proteinu je transport do lysozomu
• cis-GA - tvorba manosa-6-fosfátovvé značky
• trans-GA - pučení velkého množství váčků -> směřují k plasmatické membráně/k endosomu (do lysozomu)
• Váčky směřující do lysozomu získají speciální receptor -> ten rozpozná manosa-6-fosfát na N-glykosylovaném polysacharidu -> do vesikulů, které jsou obalené klathrinem -> fúze s pozdním endosomem
• Pozdní endosom - zde se shromažďují váčky pro degradaci v lysozomu + třídění materiálu
• Lysozomy - degradativní organely, obsahují enzymy hydrolázy pro štěpení

Question 8

Kontitutivní vs regulovaná sekrece proteinů

Answer 8

KONSTITUTIVNÍ SEKRECE:
- z trans GA se štěpí váčky -> jdou k plazmatické membráně -> fúze s membránou s vylití obsahu ven
REGULOVANÁ SEKRECE:
- Speciální typy váčků, vypučí z ER -> pod membránou čeká na signál (např. zvýšená koncentrace Ca2+)
- vstup do regulované sekreční dráhy v GA agregaci pomocí GRANINŮ

Question 9

Proteolytické štěpení pro-proteinů

Answer 9

• sekretované proteiny jsou často syntetizovány ve formě inaktivních prekurzorů - PRO-PROTEINŮ
• např. proalbumin, proinsulin
• aby z nich vznikly finální proteiny, musí být proteolyticky štěpeny - většinou v sekretorických vesikulech
• štěpení endoproteázami v GA - štěpí za sekvencemi Arg-Arg neb Lys-Arg
  PROALBUMIN:
• Odštěpení krátké N-koncové sekvence
• endoproteáza FURIN
  PROINSULIN:
• vytvoření dvou S-S můstků v ER
• většina proinsulinu musí být vyštěpena
• endonukleázy PC2, PC3

Question 10

Směřování proteinů z GA do membrány

Answer 10

• Membrány polarizovaných buněk - APIKÁLNÍ a BASOLATERÁLNÍ MEMBRÁNA
• mezi nimi TIGHT JUNCTIONS
• některé proteiny jsou určené na jednu stranu a jiné na druhou - to už může začít na trans GA
• určuje to přítomnost regulačních proteinů na váčku = RAB GTPázy a V-SNAREs (určují identitu váčku, u všech buněk)
• může být i složitější cesta (bo why not) - např. hepatocyty