3. Transkripce Flashcards
1
Q
Struktura RNA - základní údaje, struktura
A
- U místo T
- Ribóza s OH skupinou na C2
- pravotočivá šroubovice (stacking interakce)
- Většinou single strand
- negativní náboj
- Různé sekundární struktury (smyčky, vlásenky, bubliny, pseudouzly)
- neumí B konformaci, typická je A konformace
- Hybrid DNA + RNA má taky A konformaci
- umí i terciální strukturu
- Izolace RNA - potřebuju kyselé prostředí
2
Q
Enzymatická aktivita RNA + Hammerhead
A
- je velmi flexibilní
- RIBOZYMY = RNA s enzymatickou aktivitou
- První objevené ribozymy: self-splicing intron I. typu; RNAáza P (ribonukleáza)
- přirozené ribozymy štěpí svou vlastní RNA
Hammerhead ribozymy: - nejjednoduší forma
- specifická ribonukleáza viroidů - důležitá pro množení
- terciální struktura = Fish Bone, do písmena ,,V’’, dá se rozdělit na několik ramen
3
Q
Transkripce
A
- DNA do RNA
- Transkripční cyklus: Iniciace, Elongace, Terminace
- zajištěná DNA dependentní RNA polymerázou
- začátek = promotor
- konec = terminátor
4
Q
RNA polymeráza - tvar, co dělá
A
- syntéza RNA podle ssDNA, na kterém sedí
- de novo iniciace, nepotřebuje primer
- umí transkripci toho samého genu vícekrát za sebou
- 1 chyba na 10 000 nkleotidů
- tvar klepeta
- uprostřed je katalytické místo pro Mg2+ kationty (jako u DNA polymerázy)
5
Q
RNA polymeráza prokaryota
A
- uvnitř Kyselina aspargová + 2 Mg2+
- RNA Pol core:
-> jádro
-> 4 podjednotky
-> alfa - vazba aktivátorů
-> beta - katalytické místo, iniciace a prodlužování RNA
-> beta’ - spojení polymerázy s templátem
-> sigma - rozezná promotor
6
Q
RNA polymeráza - eukaryota
A
- RNA pol. I = transkripce rRNA
- RNA pol. II = transkripce mRNA
- RNA pol. III = transkripce tRNA, snRNA (small nuclei), 5S RNA (ribozomální)
7
Q
Downstream + upstream
A
- Místo začátku transkripce RNA polymerázy = +1
- pohyb zleva doprava —>
- všechno napravo od promotoru je +1 = downstream
- všechno nalevo od promotoru je -1 = upstream
8
Q
Iniciace transkripce - základ
A
- Sigma faktor RNA polymerázy pozná promotor -> tvorba Otevřeného komplexu (lokální rozpletení DNA a tvorba bubliny)
- DNA je lokálně denaturovaná mezi pozicí -11 a +3 => IZOMERACE, nevratné, není potřeba ATP
- umí syntézu de novo (bez primeru)
- regulační proteiny se vážou v blízkosti promotorů - represory snižují transkripci, aktivátory zvyšují
9
Q
Struktura RNA polymerázy
A
- žlábky a kanálky, Mg2+ ionty
- 5 kanálků:
-> vstup DNA
-> výstup RNA
-> vstup nukleotidů
-> NT kanál = non template strand DNA exit
-> T kanál = template strand DNA exit - často je první nukleotid Adenin
- před vstupem do elongace probíhá ABORTIVNÍ INICIACE:
-> syntéza krátkých RNA <10 nukleotidů, ty jsou znovu uvolněny -> syntéza znovu
-> po syntéze produktu delšího než >10 nukleotidů je vy tvořen ternární komplex, uvolní se sigma faktor -> elongace babyy
10
Q
Iniciace transkripce - kontrola
A
- replikace je helikáza, DNA pol., SSB… tady to musí zvládnou jen RNA polymeráza
- RNA polymeráza před sebou rozplétá DNA -> kontrola (proofreading):
1. PYROFOSFOLYTICKÁ kontrola
-> reinkorporace pyrofosfátu na poslední dNT
-> Párování cajk - kratší čas
-> Párování špatně - delší čas
2. HYDROLYTICKÁ kontrola
-> vyštěpení 1 či více dNT z nové RNA
-> Gre A, Gre B proteiny
11
Q
Terminace transkripce - prokaryota
A
- RNA pol. najde terminátor
- 2 typy terminátorů, protože je tak lepší možnost regulovat transkripci
- Rho-protein = ATPáza
1. RHO-NEZÁVISLÉ terminátory
-> repetice bohatá na CG, za ní 8 AT párů
-> RNA vytvoří vlásenku, při které párují CG bohaté repetice spolu -> mechanické uvolnění transkriptu (8 AT párů jsou hodně slabé)
2. RHO-ZÁVISLÉ terminátory
-> vyžadují rho-protein-> za spotřeby ATP vytáhne transkript ven z polymerázy
-> Rho utilisation site = sekvence, která po transkripci nevytváří sekundární strukturu, je bohaté na C, zde nasedá Rho protein
12
Q
Transkripce u prokaryot - co je jen tady, promotor
A
- transkripce a translace probíhá ve stejném kompartmentu, mohou tak jet současně
- otevřený komplex - není potřeba ATP, bo DNA je furt v negativních nadobrátkách
- terminátor je buď kódovaný v DNA nebo je to Rho protein (s ATP vytáhne transkript)
PROMOTOR: - asymetrický -> RNA polymeráza se může vázat jen jedním směrem (5’ -> 3’)
- má 2 sekvence 6 bp dlouhé: -10 AT oblast (např. TATA box) a -35 upstream oblast
- obě sekvence jsou rozeznávané sigma faktorem RNA polymerázy
- čím více je sekvence podobná té konzervované, tím silnější má promotor (častější transkripce, ostatní mají smůlu)
- různé variace
13
Q
Transkripce u eukaryot - oddělení RNA polymeráz od sebe, promotor
A
- RNA polymerázy jsou od sebe rozdělené na základě citlivosti k alfa-amantinu:
-> RNA pol. I - rRNA, necitlivá
-> RNA pol. II - mRNA, velmi citlivá
-> RNA pol. III - tRNA, částečně citlivá - Promotor:
-> výrazně složitější než u prokaryota
-> upstream - TATA box (TBP) a BRE element (TFIIB)
-> místo startu transkripce - iniciátorový element
-> downstream - downstream promotor element (TFIID), oblast +30
-> všechny elementy jsou vázané nějakým GTF
-> + další regulační sekvence: např. enhancery
14
Q
Transkripce u eukaryot - GTF
A
- General transcription factors
- pomáhají RNA polymeráze nasednout na promotor, rozvinout DNA a začít transkripci
- ,,II’’ - RNA polymeráza II
- stačí in vitro, ale nestačí to in vivo
- TBP:
-> = TATA binding proteins
-> váže a deformuje DNA, používá beta-list (většinou se používá alfa-helix totiž)
-> nesleduje na DNA sekvenci, ale přímo schopnost deformace
-> s TBP jsou ještě spojované TAFs - TFIIB:
-> = Transkripční faktor 2 B
-> asymetricky nasedá na BRE element (bo je upstream)
-> má na starost orientaci, nastavuje RNA pol. do správného směru - TFIID:
-> váže RNA pol. na promotory
-> nasedá na DPE a iniciátorový element - TFIIF:
-> stabilizace
TFIIE, TFIIH:
-> kontrola proměny pre-iniciačního komplexu na otevřený komplex
-> vyžadují ATP
15
Q
Transkipce u eukaryot - pre-iniciační komplex
A
- Označí promotor pro RNA polymerázu II.
- Vynucuje si ATP
1. TBP označí TATA box a vytvoří z něj základnu
2. sestaví se komplex TFIID
3. Rekrutuje se RNA pol. II, spolu s ní přilétá TFIIF
4. Navážou se další TFIIE a TFIIH
16
Q
Transkripce u eukaryot - přechod do elongační fáze
A
- únik z promotoru
- Eukaryotická RNA pol. II má C koncovou doménu -> ta obsahuje heptapeptid, který může být fosforylovaný (ale normálně není)
- po fosforylaci se uvolní GTF-> RNA polymeráza II se uvolní z promotoru -> elongace
17
Q
Transkripce eukaryot - iniciace in vivo - pre-iniciační komplex
A
- potřeba kromě GTF ještě mediátorový komplex, histonaceetyl transferáza a chromatin remodeling complex
- na enhancerové části se vážou aktivátory -> interagují s RNA pol. II přes mediátorový komplex
- Aktivátorový komplex - hodně proteinů, reguluje CTD kinázu
18
Q
Elongace transkripce - jak začíná, RNA processing
A
- začíná po fosforylaci C koncové domény RNA pol. II
- RNA pol. II nechává na promotoru GTFs a mediátorový komplex -> váže pak na C doménu elongační faktory a faktory pro úpravu RNA
- TFIIS: elongační faktor, díky němu se RNA II pol. nezasekává, stimulace hydrolytického štěpení
- RNA je schopná přivolávat proteiny pro úpravu mRNA: Capping, Splicing, Syntéza polyA konce
19
Q
Elongace - nadobrátky, eukaryota a prokaryota
A
- RNA pol. rozvine lineární DNA -> downstream jsou pozitivní nadobrátky, upstream negativní nadobrátky
EUKARYOTA: - napětí je uvolněno topoisomerázou
BAKTERIE: - Speciální topoisoomeráza = DNA gyráza
- spotřeba ATP
- ## udržuje konstantní negativní napětí -> to je spotřebované při rozvinutí DNA, takže chill
20
Q
Elongace - úpravy RNA (prokaryota, eukaryota)
A
PROKARYOTA:
- transkripty jsou polycistronní
- mRNA není posttranskripčně modifikována, takže je klidně hned translatovaná
EUKARYOTA:
- transkripty jsou monocistronní
- transkripce v jádře -> úprava mRNA -> odjezd do cytoplazmy -> translace
- posttranskripční modifikace mRNA - Capping, polyA sekvence, vystřihnutí intronů z mRNA, splicing
- primární transkript = hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)
- až poté je mRNA připravená odcestovat do cytoplasmy
21
Q
Elongace - úpravy (processing) mRNA
A
- CAPPING
- syntéza 7’ methylguanosinové čepičky na 5’ konec
- takhle se může mRNA rozeznat od jiných RNA
- chrání před degradací, role v iniciaci translace
- je připojená zvláštní 5’-5’ vazbou na první purinový nukleotid - PolyA KONEC
- 3’ konec
- C koncová doména RNA polymeráza rekrutuje 2 hlavní proteiny v CAPPING: CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor) a CSTF (cleavage stimulation factor)
- CPSF leze na polyadenylační signál
- CSTF jde na GU bohatý úsek mRNA
- na 3’ konec pak doplní PolyA polymeráza sekvenci polyA bez templátu (200 bp)
- spotřeba ATP
- stabilizace mRNA, určuje poločas života, důležitý pro translaci
- na poly-A ocásek nasedá PAP (poly-A binding protein) -> určuje délku polyA sekvencce
- v EUKARYOTA je zkrácení polyA konce = zkrácení životnosti
