2. Chromozomy Flashcards
Chromozomy - tož k čemu
- 1/2 hmotnosti tvoří proteiny
- ochrana DNA před poškozením
- možnost rovnoměrně rozložit genetickou informaci při dělení buněk
- zkompaktnění DNA
Genom prokaryota
- většinou cirkulární DNA, ale i lineární či obojí
- téměř samé geny
- jen málo nekódujících sekvencí (regulátory exprese, iniciátory transkripce, počátek replikace…)
- nemají introny (nekódující sekvence, oddělují od sebe geny)
Genom eukaryota
- několik lineárních chromozomů
- nižší hustota genů v chromozomech
- delší geny
- až 95 % genové sekvence nekódují finální protein
- 2/3 lidské genomové DNA jsou mezigenové oblasti = JUNK DNA (ale je důležitá)
- delší intergenové oblasti:
-> unikátní oblasti (fragmenty, pseudogeny)
-> repetitivní sekvence (mikrosatelitní DNA, alpha satelitní repetice centromer a telomer, transpozony) - velikost genomu je dáno životním stylem organismu
Mikrosatelitní DNA
- u eukaryota
- též tzv. STR (Short Tandem Repeats)
- dinukleotidové repetice
- např. CACACACA
Pseudogen
= Sekvence odvozená od funkčního genu
- vznik přepisem transkribované RNA pomocí reverzní traskriptázy do DNA
- cDNA nebo complementary DNA, její sekvence je shodná s mRNA
- za určitých okolností může dojít k reintegraci (znovuvložení DNA do genomu) -> vzniká pseudogen
- může obsahovat kompletní kódující sekvenci, ale chybí mu regulační oblast -> není transkripčně aktivní
- jedna z možností vzniku evolučních novinek - je to kopie původního genu, může získávat mutace a může se pak stát aktivním (dostane se před něj regulační oblast)
Nukleosom + sestavení nukleosomu
- základní struktura chromosomu
- ,,korálky” = DNA na histonech
- kondenzace DNA cca 3x
- výskyt průměrně každých 200 bp
- 1,65 závitu DNA
- lidská DNA má 30 milionů nukleosomů
- linker DNA je mezi nukleozomy
- nukleosomy spolu interagují pomocí N-konců histonů
Sestavení nukleosomu: - H3-H4 tetramer soulží jako lešení pro sestavení okatemeru, k nim se pak přidá H2A, H2B
- omotání není hladké, DNA je různě zprohýbaná
- N-konce histonů trčí ven
Linker DNA
= DNA mezi nukleosomy
- je přednostně štěpená
- vazba na histon H1 (ten je mimo nukleosom)
Histony
= silně bazické proteiny
- 142 H můstků + elektrostatické interakce v jednom nukleosomu
- bazické AMK histonů (Lys, Arg) neutralizují záporný náboj DNA
- H2A, H2B, H3, H4
- H3 v centromerách může nahradit varianta CENP-A (umí reagovat s kinetochorem)
- H3 A H4 zůstávají na starém vlákně, H2A a H2B jdou na to nové -> nové histony se přemění podle těch starých
Kontakty histonového jádra s DNA
- na DNA je nasazují histon chaperony (roli tu hrajou i clamp proteiny)
- 142 H vazeb + elektrostatické interakce
- většina vazeb mezi proteiny a atomy kyslíku fosfodiesterové kostry DNA
- jenom 7 H můstků umožňuje ohnutí DNA
- většina kontaktů je s malým žlábkem (minor groove) nebo s fosfodiesterovou kostrou DNA
- nezávislé na sekvenci
Modifikace N-konců histonů
- ACETYLACE (vznik bromodomén) a METHYLACE (vznik chromodomén) lysinu
- FOSFORYLACE serinu
- neovlivňuje to samotný nukleosom, ale spíš 30nm vlákno a struktury vyššího řádu
-> např. acetylace destabilizuje strukturu tak, že histony nemohou neutralizovat negativní náboj DNA - přidávání značek na histony pomocí histoacetyltransferázy nebo histonmethylázy
Jak mění varianty histonů funkci nukleosomů?
- přítomnost modifikovaného H2A.z neumožňuje vznik represních chromatických struktur -> chromatin je přístupnější pro transkripci
- H2A.z je za nižší teploty víc
- modifikace histonů vytvářejí vazebná místa pro proteiny s BROMODOMÉNAMI (acetylované histony) a CHROMODOMÉNAMI (methylované histony)
-> tyto proteiny, co se navážou, buď dál modifikují chromatin nebo regulují např. transkripci
Solenoidy (=solenosoidy)
= nukleosomy s navinutou DNA
= spirála vyššího řádu
- 30nm struktura
- uspořádání zick zack (více pravděpodobné z výzkumu)
Jak se může purifikované 10nm vlákno chromatinu uspořádat v závislosti na iontové síle roztoku?
- Extrémně nízká síla -> 10nm fibrila
- Nízká iontová síla -> solenoid (30nm)
- Vyšší iontová síla -> globulární strkutura (30 nm), aby byl zamaskovaný jemně negativní náboj nukleosomů (nukleosomy se tak vtěrknou do kompaktní struktury)
Modifikace značek přidávaných na N-konce histonů
- přidané pomocí enzymu HISTONACETYLTRANSFERÁZY nebo HISTONMETHYLÁZY
- většinou je to kaskáda několika proteinů, neprobíhá to v jednom kroku
- Writers: enzymy, zapisují značky
- Erasers: HISTONDEACETYLÁZA, mažou značky
- Readers: čtou značky
-> Proteiny s bromodoménou: umí najít acetylované N-konce
-> Proteiny s chromodoménou: umí najít methylované N-konce
Rozvolnění nukleosomů před transkripcí
- str. 19
- nejdřív se řeší značky na N-koncích histonů
- Aktivátor transkripce rekrutuje HISTON H3 KINÁZU -> fosforylace serinu v pozici 10 na H3 histonu -> signál pro H4 HISTONACETYLTRANSFERÁZU -> acetylace N-konce H4 -> to je značkou pro transkripční komplex s proteinem Gcn5 -> acetyluje lysin v pozici 14 na N-konci H3 -> tohle navábí RNA polymerázu -> transkripce
Chromatin remodeling complex
- umí dočasně změnit strukturu nukleosomů (DNA může být posunutá třeba)_
-> SLIDING: posun nukleosomů po DNA
-> TRANSFER: přesun nukleosomů na jiné místo na DNA - Pohyb dimerů H2A a H2B
- potřeba ATP
- je hodně druhů, není jenom jedna
Euchromatin
- málo kondenzovaný
- transkripčně AKTIVNÍ
Heterochromatin
- hodně kondenzovaný
- transkripčně NEAKTIVNÍ
- má méně genů
- často má repetitivní sekvence
- replikuje se až na konci
- FAKULTATIVNÍ HETEROCHROMATIN = umí se přeměnit na euchromatin
- KONTITUTIVNÍ HETEROCHROMATIN = to je prostě navždy hetero
Poziční efekt
- např. Drosophila - gen White, pokud je normálně transkribovaný -> červené oko, ale pokud se stane, že je umístěný nedaleko heterochromatinu -> gen je stejný, ale je umlčený
=> epigenetická informace = gen tam je, ale je umlčen
Uspořádání DNA do 30nm vlákna - model smyčky
- vlákno je navinuté na nukleární scaffold -> vznikají smyčky
- pokud je smyčka transkripčně aktivní -> dojde pak k většímu rozvolnění (větší smyčka) pro transkripci
- prokazatelně tam jsou 2 typy topoizomeráz: TOPOIZOMERÁZA II A ESSENCE PROTEINY (kondensiny a kohesiny) = pomáhají skládat kondenzovaný chromosom
2 typy topoizomeráz v modelu smyčky DNA
- Topoizomeráza II
- Essence proteiny
- Koheziny = drží dohromady mitotické/meiotické chromatidy
- Kondensiny:
-> v interfázi smotávají chromozomy do kompaktnější struktury pro mitózu
-> potřebují ATP
-> Obě skupiny sdílejí stejné ATPázové podjednotky (SMC2 a SMC4)
-> Obě skupiny mají jiné regulační proteiny
-> Skupina I = smyčky DNA velké 90 bp
-> Skupina II = smyčky DNA velké 450 bp
SMC proteiny
- dimery
1. Pantová doména (jak pant u dveří)
2. Coiled coil
3. N a C konce + ATPázová doména
LADs a TADs
- rozdělení genomu vyšších eukaryot
- jsou udržované kontakty mezi nukleosomy a v TADs i kohesiny s CTCF proteiny
LADs:
-> Laming Asociated Domains
-> části chromatinu asociované s jádrovou membránou
-> méně dynamické
TADs:
-> Topologicky Asociované Domény
-> velké stovky kbp
Loop extrusion model
- Spojí se dvě kotvící místa vzdálené daleko od sebe -> smyčka
- Extrusion (vytlačovací) komplex se nasadí na DNA -> jeho 2 podjednotky (kohezinové kruhy) kloužou po DNA v opačných směrech -> zvětšují smyčku -> po kontaktu CTCF motivu s extrusion komplexem se smyčky zastaví
- smyčka je ukotvená extrusion komplexem s CTCF motivy
Centromery - kolik, co mají, S. cerevisiae
- 1 v každém chromozomu
- mají dlouhé úseky heterochromatinu
- váže se na ni kinetochor
- Methylované a hypoacetylované histony
- Silencing genů vložených do této oblasti
- Alpha satelitní DNA - hodně AT párů
- Kvasinka S. cerevisiae - speciální varianta H3 histonu -> tvorba speciálního nukleosomu typického pro seniory
Replikační počátek - kolik
- Prokaryota 1
- Eukaryota MNOHO, 30-40 kbps od sebe
Telomery - co mají, uspořádání
- na každém konci lineárního chromozomu
- navázané proteiny brání degradaci a rekombinaci
- fungují jako speciální replikační počátky
- část telomer má ssDNA
- obsahují TG repetice
- konce telomer přesahuje 3’ konec => speciální počátek replikace pro telomerázu
- telomerická DNA uspořádaná do T loop (t smyčka) + koncová část je heterochromatin
- Telomere binding proteins => udržují strukturu telomer
Iniciace replikace u prokaryota + regulace (kdy)
- E. Coli má genom velký 4,6 x 10*6
- jediný Ori C
- rozvinutí DNA je pod kontrolou Iniciátorového proteinu DNA A
- replikační vidličky běží proti sobě
- jediná možnost regulace je před zahájením replikace
Regulace: - Jen v iniciační části
- iniciace replikace je pod přísnou kontrolou a začne jenom při dostatku živin
Iniciace replikace u prokaryota - děj
- Helikáza = DNA B
- Inhibitor helikázy = DNA C
- DNA primáza = DNA G
- na Ori C se naváže iniciátorový protein DNA A -> přidá se helikáza DNA B s indikátorem helikázy DNA G -> tvorba replikační vidličky = primosom (DNA B + primáza DNA G)
Refrakterní perioda u prokaryot (replikace)
- Doba, po kterou nemůže nastat iniciace
- Aby po replikaci nebyla okamžitě další replikace
- v Ori C je 11 motivů GATC -> adenin je methylován -> HEMIMETHYLOVANÝ STAV = jedno vlákno je methylované a to nové není -> hemimethylovaný úsek je rozpoznaný proteinem SeqA -> brání další methylaci a iniciaci DNA A na Ori C
Replikace u eukaryot - kdy, Ori C…
- Eukaryotická vidlička urazí asi 1/10 rychlosti za sekundu
Ori C:
-> mnoho
-> aktivace v S fázi, ale nejsou všechny aktivované současně
-> Výběr Ori C proběhne v G1 fázi -> aktivace v S fázi - Euchromatin se replikuje dřív
- Pre-replikační komplex (označení Ori C)
Replikace u eukaryot - Licensing systém (pre-replikační komplex)
= označení Ori C
- Na Ori C přiletí proteinový komplex ORC (origin recognition complex) -> pozná počátek a rekrutuje helicase loading proteiny (pro nasednutí helikázy) -> nasednutí na obě strany helikázový komplex replikační vidličky Mcm2-7 -> hotovo
- vytvořený v G1 fázi = Licensing (označení Ori C), ale aktivace v S fázi
Replikace eukaryot - Jak je zajištěno, aby žádný počátek nebyl aktivován vícekrát za buněčný cyklus?
- Cdk = Cyklin Dependentní Kinázy
- nízká aktivita -> tvorba pre-replikačního komplexu, ale brání jeho aktivaci
- vysoká aktivita -> brání tvorbě nový pre-replikačních komplexů, aktivace (S fáze)
Terminace replikace chromozomů - Cirkulární DNA
- replikační vidličky putují proti sobě -> setkají se -> KATENÁT
- Katenát = propletení kružnic DNA
- Dekatenace = rozpletení, Topoisomeráza II
- Na genomu je několik TER míst -> mají v sobě TUS místa -> zpomalení replikační vidličky
Řešení krátkého konce Lagging strandu - ,,Rolling circle’’:
-> kružnicová molekula s jednovláknovým nickem replikuje nové vlákno -> vznik produkt s kopiemi plasmidu za sebou -> rozstříhání a zaligování
-> vytvořené utajené přerušení (,,ss nick’’)
Terminace replikace chromozomů - Lineární DNA - problém + řešení
- Problém při dosyntetizování konců lagging vlákna
- na Lagging vlákně je poslední Okazakiho fragment odstraněný aktivitou RNAázy H -> je zkrácené
- takhle krátké vlákno se nesmí použít při replikaci -> pořád by se nová vlákna zkracovala
Řešení - Viry: - proteinový primer -> poskytne 3’ OH skupinu -> váže se na konec vlákna -> DNA polymeráza pak OH skupinu využije na dosyntetizování
- Telomere binding proteins => udržují strukturu telomer
Telomeráza - co to je, co dělá, co potřebuje
- pro telomerázu jsou speciální Ori C na telomerách => prodloužený 3’ konec
- protein+RNA
- nepotřebuje DNA templát, pro to funguje RNA složka komplexu
- funguje vlastně jako reverzní transkriptáza (syntéza DNA podle RNA)
- Produkt = ssDNA
- Heyflickův limit
Telomeráza - Heyflickův limit
- Při vypnutí telomerázy se zkracují telomery a buňka má omezený počet buněčného dělení
- Telomeráza je vyplá u somatických buněk člověka a savců
