1. Replikace DNA Flashcards
3 modely replikace DNA
- Semikonzervativní
- Konzervativní - podle obou vláken se vytvoří nová vlákna
- Disperzní - původní vlákno je rozděleno na krátké úseky -> nehrozí zamotání
Meselnson & Stahl
- ,, Semikonzervativní proces is the way’’
- bakteriální buňky pěstované v médiu s těžkým dusíkem 15N -> 1 generace vložená do média s 14N -> analýza DNA
Arthur Kornberg
- izolace DNA polymerázy I
- ,,Na replikaci jsou potřeba 4 DNT, Mg kationty a templátové vlákno DNA
DNA polymeráza I
- Arthur Kornberg
-> PALM doména - kontroluje správné párování posledního nukleotidu
-> FINGER doména - uzavře dNTP v katalytickém místě, správné párování: stacking interakce + ohýbá ssDNA o 90 stupňů -> je zaručeno, že v katalytickém místě je jen správná templátová báze - > THUMB doména - drží nově syntetizovanou DNA
- Mg 2+ ionty: snižují afinitu 3’ OH skupiny vůči vodíku -> umožňují napadení fosfátové skupiny
- po nasednutí klouže podél templátu
- až 1000 nukleotidů/s
- oprava chyb tzv. 3’ -> 5’ exonukleázovou aktivitou PALM domény = tlačítko DELETE
Helikáza
- spotřeba ATP
- ,,On sa tóčí’’
- zařazuje jen dNTP, ale pro iniciaci syntézy může použít i primer
- uvolňuje dsDNA
- nasedá na DNA pomocí inhibitoru helikázy
- 3’->5’ i 5’->3’
- ## Hexamerní kruh = 6 podjednotek, každá má místo pro ATP
SSB proteiny
= Single Strand Binding proteins
- stabilizují ssDNA úseky (pro buňku je neslýchané, aby se někdo poflakovala ssDNA)
- využití elektrostatických interakcí
Lagging strand
- Druhé, opožděné vlákno
- je syntetizováno opačně než je směr otevírání replikační vidličky -> to jest 3’ -> 5’
- Syntéza po krátkých úsecích = Okazakiho fragmenty
Okazakiho fragmenty
- na lagging strand
- malé nasyntetizované fragmenty, pak se propojí
- Odstranění:
-> RNáza H1 - odstraní RNA, zůstane DNA primer a kousíček RNA pro endonukleázu
-> endonukleázy fen1, dna2
DNA polymeráza III
- vypadá jak ženský pohlavní orgán
- ,,core enzym’’, holoenzym
- multi proteinový komplex
- potřebuje primer na začátek syntézy
- na zrychlení jsou použité svorkové (clamp proteiny
Obsahuje:
-> 2x DNA polymeráza III
-> 2x tau protein (spojuje polymerázy s gamma komplexem)
-> 1x gamma komplex = Clamp loader - interakce s helikázou přes tau protein
Primáza
- Přidá DNA poly. I primer pro začátek syntézy
- speciální RNA polymeráza
- je aktivovaná spojením s helikázou
- primer je pak odstraněn pomocí RNAázy H (slouží i jako značka pro odstranění, bo je RNA)
DNA ligáza
- spotřeba ATP
- obnova fosfodiesterové vazby a zacelení ssDNA
Topoisomerasy - funkce
- odstranění pozitivních nadobrátek před vznikem replikační vidličky
DNA gyráza
= speciální typ topoisomerásy
- umí generovat negativní nadobrátky bakteriální genomové DNA -> DNA je tedy stále udržovaná v negativních nadobrátkách
Svorkový (clamp) protein
- zvýšení procesivity u DNA pol. III
- brání odpojení DNA pol. III od DNA
- 2 monomery
- vlákno DNA vleze do centrální dutiny
- struktura donutu
- na DNA jsou nasazovány pomocí Sliding clamp loaders
Sliding clamp loaders
- Součást DNA polymerázy III
- umí otevřít/zavřít svorkový (clamp) protein -> nasazení na DNA
- spotřeba ATP
- 5 podjednotek
Replizom
= Soubor všech proteinů účastnících se replikace
Model replikace DNA
DNA POLYMERÁZA III reaguje s HELIKÁZOU přes tau protein -> vznik LEADING a LAGGING STRANDS
- na lagging strand: napojí se SSB -> DNA PRIMÁZA periodicky vytvoří primer -> po dokončení OKAZAKIHO FRAGMENTU se DNA polymeráza III uvolní ze svorkového (clamp) proteinu a vlákna -> lagging strand s novým primerem se přesune do SLIDING CLAMP PROTEINU a svorkový clamp protein se znovu napojí na DNA polymerázu III -> syntéza dalšího Okazakiho fragmentu
