Realtids PCR

Question 1

Vad är primers?

Answer 1

Korta syntetiskt framställda bitar av DNA-strängen som består av rätt oligonukleotider i rätt ordning. Fungerar som en startsekvens för att kunna påbörja PCR-reaktionen.

Question 2

Vad gör fria oligonukleotider?

Answer 2

Bygger den nya DNA-stränfen. DE befinner sig i lösningen och när de träffar rätt kommer de att sammanfogas och bilda DNA

Question 3

Vada gör polymeraset?

Answer 3

Påskyndar sammanfogningen av de fria oligonukleotiderna som finns i lösningen

Question 4

Vad gör bufferten

Answer 4

INnehåller magnesiumklorid och kaliumklorid och används för att reglera pH-värdet under hela processen. Den underlättar samt skundar på PCR-reaktionen genom att hjälpa polymeraset att göra sitt jobb. KOncentrationen på magnesiumklorid kan variera och påverkar både hur effektivt och noggrant reaktionen går då magnesiumet är en så kallad co-faktor som binder till polymeraset och aktiverar det.

Question 5

Vilka steg ingår i PCR?

Answer 5

Denaturering
Hybridisering
Elongering

Question 6

Vad sker i denatureringsfasen

Answer 6

Dubbelsträngat DNA används som mall och delas upp genom att temperaturen höjs till 94-96°C-. Tack vare den höga temperaturen börjar molekylerna röra på sif och denna rörelseenergi får vätebindningarna att gå isär, och på sp vis separeras det dubbelsträngade DNA:t

Question 7

Vad sker i hybridiserings fasen?

Answer 7

Temperaturen sänks till 55-60 grader och nu binder primrarna till DNAt

Question 8

Vad sker i elongeringsfasen? OBS värdens längsta beskrivning sorry

Answer 8

Temperaturen höjs till ungerfär 68-72 grader, vilket är ett optimalt temeraturintervall för polymeraset. I detta dteg syntetiserar polymeraset en ny DNA-sträng som är komplementär med templatet genom att tillsätta nukleotider som passar ihop med templatet i riktining 5´–> 3´.

Detta leder till att 5´-fosfatgruppen på nukleotiderna kondenserar medan 3´-hydroxylgruppen hamnar i slutet på den framväxande DNA-strängen.

Polymeraset arbetar så långt det bara går med att koppla samman templatet med fria oligonukleotider och på det viset skapa nytt DNA.

Därefter börjar hela processen om igen.

Question 9

vad är skillnaden på vanlig PCR och qPCR?

Answer 9

Vid qPCR kan man följa amplifieringen i realtid.

Man använder sig av en prob, inmärkt med fluorokrom i ena änden (5´) och en quencher i andra änden.

Question 10

Beskriv stegen av qPCR

Answer 10

Under amplifieringsfasen vinder proben in till målsekvensen.

Vid elongeringsfasen hydrolyseras ptoben av taq-polymerasets exonukleas aktivitet. Då skiljs reporten och quenchern åt.

Energi frisätts då från reportern i form av fluorescens som mäts av detektorn i PCR-instrumentet.

Question 11

Vad vill man åtkomma med en kvalitativ qPCR?

Answer 11

MAn söker endast att påvisa eller inte påvisa en sökt nukleinsyra.

Question 12

Vad vill kvantitativ qPCR åtkomma?

Answer 12

Man vill utföra en koncentrationsbestämning av produkten. Kräver en standardkurva men bestämda standardprov med kända koncentrationer.

Question 13

vad står qRT-PCR för?

Answer 13

Kvantitativ reverse transkriptase PCR

Question 14

När används qRT-PCR?

Answer 14

När startmaterialet är RNA

Question 15

Varför behöver man göra qRT-PCR?

Answer 15

För att vanlig PCR kan inte göras om startmaterialet är RNA

Question 16

vad krävs för att enzymet ska kunna bilda cDNA, ge exempel på dem

Answer 16

Primrar

• Genspecifika primrar
• Oligo dT primrar
  random hecamer primrar

Question 17

Vad är skillnaden på qRT-PCR i ett steg vs två?

Answer 17

Vid ett steg kombineras omvänd transkription och qPCR i ett rör. RNA templat tillsätts till ett rör med omvänt transkriptas, DNA-polymeras och resterande komponenter som behövs för reaktionerna.

Vid två stegs analys sker omvänd transkription och qPCR i separata rör.

Question 18

Vad är sybr green?

Answer 18

Ett cyaninfärgämne vilket fungerar som en DNA-bindande molekyl. Den vinder primärt till dsDNA men kan också bilda till ssDNA och RNA.

Question 19

Vid vilken våglängd absorberar sybrgreen bäst ljus?

Answer 19

497 nm (vilket emmiteras ut som våglängden 520)

Question 20

När rekommenderas SYBR green?

Answer 20

Vid Mass screening, microarray validation, multiple target genes och gene expression analys

Question 21

Vad finns det för för och nackdelar med sybr green?

Answer 21

+ Krävs inga prober
+ billigare

• binder till allt dsDNA vilket kan leda till ospecifik inbindning

Question 22

Hur fungerar smältpunkts analys?

Answer 22

Analysen går ut på att höja temperaturen långsamt och mäta flourescenceintensiteten kontinuerligt, med sybr green kommer fluorescenceintensiteten minska i takt med att dsDNA denatureras (pga bundet sybr green binder starkare än fritt)

Question 23

Vad finns det för fördelar och nackdelar med probe baserad real-time PCR?

Answer 23

+ Mer specifik då sekvensspecifika prober är designade att hybridisera till en komplementär DNA-sekvens
+ Kan användas för mass screening, genom att använda prob med olika reporterfärger kan man detektera fler än en målsekvens i samma brunn

• Tidskrävande och dyr metod då en specifik prob skall designas och syntetiseras till varje analys

Question 24

VAd finns det för fördelar och nackdelar med SYBR Green qPCR?

Answer 24

+ Lättare och mindre kostsam metod än probe-baserad Real-time PCR

• Mindre specifik så set kan leda till ospecifika bindningar, ger falskt positiva svar