ddPCR Flashcards
Vad står ddPCR för?
Droplet digital polymerase chain reaction
Vad används metoden för?
Detektera och kvantifiera nukleinsyra som tex DNA och RNA
Hur bildas dropparna i ddPCR?
med ett vattenolja-emulsionsdropp system.
I emulsionen bildas droppar som används för att bilda ratitionerna för att separera mall-DNA molekylerna.
Proverna delas upp i tusentals droppar som är enhetliga i volym och storlek.
Vad har dropparna för funktion?
Samma funktion som provrör och brunnarna i en platta men är mycket mindre.
Hur mäts och detekteras målsekvenserna i dropparna?
beräknas genom mätning med Poissons distribution och alla partiklar innehållande amplifierade målsekvenser detekteras med hjälp av fluorescens.
Vad sker efter PCR-amplifieringen?
En droppläsare används för att individuellt analysera varje droppe med hjälp av ett tvåfärgsdetekteringssystem som gör att man kan göra en multiplex analys i samma prov för olika mål.
PCR-positiva och PCR-negativa droppar räknas i programvaran och droppläsaren, och fluorescen i två optiska kanaler samlar ihop beräkningen av antalet positiva och negativa droppar per prov.
Analys av varje droppe görs för att beräkna fraktionen
För vilka syften används ddPCR?
När man vill noggrant bestämma variation of kopianummer, mäta genuttrycksnivårer eller hitta unika DNA-kopior
Vad finns det för fördelar med ddPCR jämfört med PCR?
- ddPCR har ett mindre provkrav än PCR och andra metoder vilket bevarar andra prov och minskar kostnaden
- PCR behöver standardkurvor för att ge en absolut kvantifierad sekvens vilket ddPCR inte behöver
- ddPCR är mer resistent till PCR-inhibitorer till skillnad mot PCR
- För precision är ddPCR mycket bättre när det gäller genomfiltrering.
- ddPCRs dropanalys är mer noggrann än andra metoder och innebär amm man kan analysera mer komplexa blandningar och prov.
- I jämförelse med standard qPCR så har självkomplementära vektorer av ddPCR 2-2,3 gånger högre
Vad finns det för nackdelar med ddPCR?
- Maskninen och reagenserna är dyra
- Risken för kontamination är högre
