Long PCR Flashcards
Vad används long PCR för?
Bland annat för amplifiering av stora fragment i samband med kloning.
Vilka vektorer kan klona stora fragment?
Vektorer som lambdafager eller kosmider som är kapabla att ta emot stora fragment
Vad avgörande för att kunna amplifiera ett långt fragment?
Det måste vara rent och helt
Vad ska man tänka på när man designa primrar för long PCR
Man vill undvika att designa primrar som kan skapa sekundärstrukturer med varandra (primer dimerer) eller med sig själva (hairpin loops)
Primrarna är oftast längre och har ett högre G-C innehåll än primrar för rutinmässig PCR.
Man har också en större mängd primrar
Vad betyder processivitet?
Hastigheten som polymeraset syntetiserar ett nytt fragment
Vad syftar noggrannhet till?
Hur ofta polymeraset använder fel nukleotid under syntetiseringen.
Vilka sorters polymeras kan användas?
Taq-polymeras, hot-start polymeras (måste aktiveras med hög temperatur i termocykeln innan det kan katalysera sin reaktion)
Finns även värmestabila polymeraser som tål höga temperaturer över längre tid
Vent-polymeras (ökar noggranheten)
Vad har vent-polymeras för egenskaper
Har proof-reading förmågor, kan rätta till eventuella felinkorporerade nukleotider vid 3´änden av den växande strängen.
varför använder man buffert med ett högre pH? (8-9)
Det föhindrar hydrolys av fosfodiesterbindningar i DNA:t när det utsätts för höga temperaturer över längre tid.
Förhindrar också depurinering.
Hur skilljer sig bufferten från den använd vid vanlig PCR?
- Större mängd dNTP
- Högre koncentrationer av MgCl2
- Tillsatts av andra kemikalier som glycerol, formamid och dimetylsulfoxid (DMSO) (sänker smälttemperaturen för dsDNA, vilket resucerar temperaturstress man utsätter sina reaktionskomponenter för)
Hur ser termocyklerna ut?
- Denaturering i 10-15 sekunder vid ca 94°
- 15 cykler med denaturering (10 sekunder vid 94°)
- kombinerad annealing och extension 10-30 min vid ca 68° (temperaturen är primer och enzym beroende)
- upprepas
- Slutförlängningen ska vara samma temperatur som förlängningen
Vad är en kloningsvektor?
En DNA-molekyl där man limmar in sin sekvens, för att därefter inducera vektorn in i en värdcell som sedan uttrycker produkten som sekvensen kodar för.
Består av gener nödvändiga för dess funktion såsom ett replication of origin-site, en selektionsmarkör som ex antibiotikaresitens samt multiple cloning sites.
Vad är en lambdafag? vad gör den?
En bakteriofag som naturligt infekterar E.coli.
Har ett linjärt genom med sk cos-sekvenser i båda ändarna dessa vill autoligera då fagen har infekterat cellen och skapar då ett cirkulärt komplex utanför värdcellens genom såsom en plasmid. Klyvning av cos-sekvensen i den cirkulära strukturen gör att det automatiskt packas av lambdafag-proteiner så att det bildas en ny fag
Hur stort borde fagens genom vara för att den automatiskt ska kunna paketeras efter klyvningen av cos-sekvensen?
40 och 53 kb
Vad är kosmider?
Hybrider mellan plasmider och lambdafager.
