Quiz 2 : transcriptomique Flashcards
Quelles techniques servent à quantifier l’expression des gènes?
le buvardage northern
PCR +RT-qPCR
Puces à ADN
Séquencage d’ARN
Selon quel principe fonctionne le buvardage northern?
On peut séparer les molécules d’ARN sur gel selon leur taille par électrophorèse puis hybrider ceux-ci sur une membrane
Pourquoi est il essentiel d’utiliser un milieu dénaturant lors d’un northern Blot
Les ARN sont un brin unique qui risque de se replier dans une conformation 3D stable sur gel. Le milieu dénaturant empêche l’ARN de se replier
Quelles sont les trois bandes qui devraient être plus intense dans un extrait d’ARN total après l’électrophorèse?
Les ARN ribosomaux
Pourquoi utilise-t-on du papier absorbant pour transférer l’ARN du gel vers une membrane après l’électrophorèse?
Pour créer un effet capillaire qui emporte l’ARN vers le papier, seulement pour être attrapé par la membrane
Comment peut on quantifier un échantillon d’ARN par buvardage northern
La sonde utilisée pour révéler le gène révele aussi un controle pour une bande pour un gène dont l’expression est connu et constante est connu
pourquoi la quantification de l’ARN se fait par unité d’expression plutot que de concentration
L’expression d’un gène est directement proportionnel à la quantité de son ARN.
Comment mesure-t-on la taille d’un transcrit sur la membrane du northern blot?
en utilisant des marqueurs de taille moléculaire qui seront révélés en même temps que les ARN sur la membrane
Quels sont les points les plus importants lors de la réalisation d’un northern blot
Il faut éviter la dégradation des ARN par des RNases
il faut choisir judicieusement la température d’hybridation des sondes
Quelle est générallement la température d’hybridation des sondes lors d’un Northern blot
25 degrés sous le tm de ces sondes
Les sondes sont elles plus spécifiques à haute température ou à faible température?
à haute température.
quel type d’ADN est analysé lors d’un RT-qPCR et comment est il préparé
ADNcomplémentaire.
on utilise un reverse transcriptase pour faire de l’ADN complémentaire au brin d’ARN présent initialement dans l’échantillon
quels types d’amorces peuvent être utilisés pour faire la reverse transcriptase? quel type d’ARN est rétro-transcrit par ces amorces?
des amorces spécifiques à un gène d’interêt : seulement le gêne d’interêt
Des amorces aléatoires: tous les ARN de l’échantillon
Des amorces poly-dT: tout les ARN qui possèdent une séquence poly-A, donc les ARNm
qu’est ce que le point CT dans un qPCR.
Comment ce CT est il correlé avec la quantité d’ARN initialement analysé?
c’est le point ou la fluorescence de l’échantillon d’ARN traverse un threshold spécifique.
Plus le CT est faible, plus il y avait d’ARN dans l’échantillon initial
plus le CT est élevé, moins il y avait d’ARN dans l’échantillon initital
comment fonctionne l’agent fluorescent SYBR green
Le fluorescent n’émet de la lumière que lorsqu’il est lié dans l’ADN double brin.
il émet donc de plus en plus au fur et à mesure que les cycles de PCR passent
Comment fonctionne les sondes Taqman
Elles dépendent de l’activité 5’-3’ exonucléases de la Taq polymérase (activité charrue) pour retirer la sonde de l’ADN, ce qui libère sa portion fluorescente d’une portion quencher
quelle sonde entre SYBR green et Taqman est spécifique à un gène précis?
La sonde Taqman
peut on détecter plusieurs gènes différents avec la sonde Taqman ou SYBR green lors du qPCR.
Comment?
oui, on peut mettre des fluorophores de couleurs différentes pour des gènes spécifiques avec la sonde Taqman
expliquer la méthode relative pour la quantification de l’ADN dans un qPCR
on compare l’abondance d’un ADN avec d’autres échantillons qui proviennent de gène ‘‘housekeeping’’ qui ne varient que très peu.
expliquer la méthode absolue de quantification d’ADN par qPCR
on compare l’abondance d’un ADN avec un standards interne pour lequel on connait la concentration exact en ADN (préparation de plasmides avec courbes standard)
quels sont les controles critiques du RT-qPCR
Controle 1: s’assurer du bon état des ARN que l’on analyse. Des ARN dégradés ne donneront pas des résultats fiables
Controle 2: faire une réaction de RT sans transcriptase inverse pour vérifier s’il y a de l’ADN génomique dans l’échantillon d’ARN initial
Controle 3: Utilisation de standards internes dans les qPCR avec des gènes dont l’expression ne varie pas pour minimiser l’impact des manipulations sur les résultats
à quoi sert la courbe de dissociation dans un RT-qPCR?
à détecter la présence de contaminants dans l’échantillon
Comment interprete-t-on les résultats d’une courbe de dissociation pour un RT-qPCR
Chaque pic correspond à un produit amplifié.
La présence de 2 ou plus pics démontre donc qu’il y a un contaminant
qu’est ce qu’on retrouve sur une puce à ADN?
Tout les gènes qu’on souhaite analyser dans les échantillons
La puce à ADN analyse combien d’échantillons en même temps. pourquoi ne peut on pas en analyser plus?
- la puce à ADN sert à comparer l’expression dans deux échantillons. on ne peut donc pas comparer plus de deux échantillons l’un contre l’autre
Quel marquage est utilisé dans une puce à ADN. ou ce trouvent ces marqueurs
Des fluorophores qui se trouvent sur l’ADNc des échantillons
quelles sont les principales limitations des puces à ADN
1: le signal fluorescent n’est plus linéaire à certaines concentrations d’ADN
2: on ne peut pas analyser des molécules dont la séquence est inconnu avant l’experience
en quoi le RNA-seq est il semblable à la puce à ADN?
Le RNA-seq compare aussi l’ARN d’une population en comparaison avec une banque de gènes
Chez la puce à ADN, on hybride l’échantillon sur des gènes
Chez le RNA-seq, on séquence et aligne l’ARN sur le génome de l’organisme
pourquoi est il nécessaire de se débarasser de l’ARN ribosomal dans le RNA-seq
puisque l’ARNr est en grande majorité dans l’ARNtotal, il serait du gaspillage de séquencer tout l’échantillon s’il contient majoritairement l’ARNr
Comment fait on pour éviter le séquencage l’ARNr lors d’une expérience de RNA-seq
option 1: on sélecte les ARNm avec leur queue poly-A que l’on ne retrouve pas chez les arnr
option 2: on hybride les ARNr pour les retirer de l’échantillon
existe-t-il des kit commerciaux pour retirer l’ARNm d’un échantillon? Comment fonctionne cette méthode
Oui, MICROBExpress etRibo-zero sont des kit commerciaux qui servent à retirer l’ARNm d’un échantillon puis celui-ci peut être retiré du mélange à l’aide d’un aimant.
Comment déplètent-on l’ARNr par utilisation d’une nucléase spécifique aux molécules double-brin?
l’ADNc est dénaturé pui renaturé en présence de la nucléase qui élimine l’ADN double brin
Les ADN qui vont s’hybrider les plus rapidement sont ceux qui sont le plus abondants
que veut dire l’acronyme FPKM et dans quelle technique applique t-on cette mesure
Fragment Per Kilobase per Million mapped reads
On s’en sert dans les expérience de RNA-Seq pour mettre en relation la quantité
Pourquoi peut on analyser des ARN inconnus avec le RNA-seq mais pas avec la puce à ADN
Parce que le RNA-seq compare les séquences d’ARN au génome tandis que la puce compare avec des séquences nucléiques sur la puce.
comment peut on détecter le sens d’un transcrit avec le RNA-seq?
des dUTP sont ajoutés pour faire le brin complémentaire à l’ARN. Ces dUTP permettent la destruction du brin par l’enzyme Uracil-N-glycosylase.
Il reste ensuite seulement le brin d’ADN complémentaire original (complémentaire à l’ARNm)
Les amorces uniques en 5’ et 3’ permettent de séquencer le brin dans un sens ou dans l’autre
Comment se faisait le séquencage de protéines par la dégradation d’Edman
Le résidu N-terminal était retiré de la protéine à l’aide du PITC pui on pouvait analyser l’identité de ce résidu par séparation HPLC
Le cycle de dégradation était répété pour chaque résidu
combien d’acides aminés pouvaient être séquencés par la dégradation d’Edman, comment pouvait-on dépasser cette limite
40-50 résidus. pour aller plus loin, on devait dégrader la protéines en plus petits morceaux, séquencer chaque morceau puis assembler les séquences ensemble pour obtenir la protéine native
quelle est la méthode moderne pour séquencer des protéines?
la spectrométrie de masse
quelle enzyme est utilisée pour digérer les protéines pour une analyse au spectromètre de masse
la tripsine
comment analyse-t-on le spectre de masse d’une protéine suite à la digestion à la tripsine
On compare le spectre à une banque de donnée
peut on quantifier les protéines par la spéctrométrie de masse?
Si oui, comment?
théoriquement, oui mais c’est très difficile
on peut normaliser par rapport aux autres protéines dans l’échantillon avec des standards internes connu
comment peut on comparer l’abondance relative de peptides provenant de deux échantillons avec une méthode par spectrométrie de masse
on marque les peptides d’un échantillon avec de ‘Arginine ‘‘lourde’’ et l’autre échantillon avec de l’arginine ‘‘légère’’
Il y aura donc un légère différence de masse entre les peptides des deux échantillons et on pourra comparer les échantillons
