Quiz 2 : transcriptomique

Question 1

Quelles techniques servent à quantifier l’expression des gènes?

Answer 1

le buvardage northern
PCR +RT-qPCR
Puces à ADN
Séquencage d’ARN

Question 2

Selon quel principe fonctionne le buvardage northern?

Answer 2

On peut séparer les molécules d’ARN sur gel selon leur taille par électrophorèse puis hybrider ceux-ci sur une membrane

Question 3

Pourquoi est il essentiel d’utiliser un milieu dénaturant lors d’un northern Blot

Answer 3

Les ARN sont un brin unique qui risque de se replier dans une conformation 3D stable sur gel. Le milieu dénaturant empêche l’ARN de se replier

Question 4

Quelles sont les trois bandes qui devraient être plus intense dans un extrait d’ARN total après l’électrophorèse?

Answer 4

Les ARN ribosomaux

Question 5

Pourquoi utilise-t-on du papier absorbant pour transférer l’ARN du gel vers une membrane après l’électrophorèse?

Answer 5

Pour créer un effet capillaire qui emporte l’ARN vers le papier, seulement pour être attrapé par la membrane

Question 6

Comment peut on quantifier un échantillon d’ARN par buvardage northern

Answer 6

La sonde utilisée pour révéler le gène révele aussi un controle pour une bande pour un gène dont l’expression est connu et constante est connu

Question 7

pourquoi la quantification de l’ARN se fait par unité d’expression plutot que de concentration

Answer 7

L’expression d’un gène est directement proportionnel à la quantité de son ARN.

Question 8

Comment mesure-t-on la taille d’un transcrit sur la membrane du northern blot?

Answer 8

en utilisant des marqueurs de taille moléculaire qui seront révélés en même temps que les ARN sur la membrane

Question 9

Quels sont les points les plus importants lors de la réalisation d’un northern blot

Answer 9

Il faut éviter la dégradation des ARN par des RNases

il faut choisir judicieusement la température d’hybridation des sondes

Question 10

Quelle est générallement la température d’hybridation des sondes lors d’un Northern blot

Answer 10

25 degrés sous le tm de ces sondes

Question 11

Les sondes sont elles plus spécifiques à haute température ou à faible température?

Answer 11

à haute température.

Question 12

quel type d’ADN est analysé lors d’un RT-qPCR et comment est il préparé

Answer 12

ADNcomplémentaire.
on utilise un reverse transcriptase pour faire de l’ADN complémentaire au brin d’ARN présent initialement dans l’échantillon

Question 13

quels types d’amorces peuvent être utilisés pour faire la reverse transcriptase? quel type d’ARN est rétro-transcrit par ces amorces?

Answer 13

des amorces spécifiques à un gène d’interêt : seulement le gêne d’interêt
Des amorces aléatoires: tous les ARN de l’échantillon
Des amorces poly-dT: tout les ARN qui possèdent une séquence poly-A, donc les ARNm

Question 14

qu’est ce que le point CT dans un qPCR.

Comment ce CT est il correlé avec la quantité d’ARN initialement analysé?

Answer 14

c’est le point ou la fluorescence de l’échantillon d’ARN traverse un threshold spécifique.
Plus le CT est faible, plus il y avait d’ARN dans l’échantillon initial
plus le CT est élevé, moins il y avait d’ARN dans l’échantillon initital

Question 15

comment fonctionne l’agent fluorescent SYBR green

Answer 15

Le fluorescent n’émet de la lumière que lorsqu’il est lié dans l’ADN double brin.
il émet donc de plus en plus au fur et à mesure que les cycles de PCR passent

Question 16

Comment fonctionne les sondes Taqman

Answer 16

Elles dépendent de l’activité 5’-3’ exonucléases de la Taq polymérase (activité charrue) pour retirer la sonde de l’ADN, ce qui libère sa portion fluorescente d’une portion quencher

Question 17

quelle sonde entre SYBR green et Taqman est spécifique à un gène précis?

Answer 17

La sonde Taqman

Question 18

peut on détecter plusieurs gènes différents avec la sonde Taqman ou SYBR green lors du qPCR.
Comment?

Answer 18

oui, on peut mettre des fluorophores de couleurs différentes pour des gènes spécifiques avec la sonde Taqman

Question 19

expliquer la méthode relative pour la quantification de l’ADN dans un qPCR

Answer 19

on compare l’abondance d’un ADN avec d’autres échantillons qui proviennent de gène ‘‘housekeeping’’ qui ne varient que très peu.

Question 20

expliquer la méthode absolue de quantification d’ADN par qPCR

Answer 20

on compare l’abondance d’un ADN avec un standards interne pour lequel on connait la concentration exact en ADN (préparation de plasmides avec courbes standard)

Question 21

quels sont les controles critiques du RT-qPCR

Answer 21

Controle 1: s’assurer du bon état des ARN que l’on analyse. Des ARN dégradés ne donneront pas des résultats fiables
Controle 2: faire une réaction de RT sans transcriptase inverse pour vérifier s’il y a de l’ADN génomique dans l’échantillon d’ARN initial
Controle 3: Utilisation de standards internes dans les qPCR avec des gènes dont l’expression ne varie pas pour minimiser l’impact des manipulations sur les résultats

Question 22

à quoi sert la courbe de dissociation dans un RT-qPCR?

Answer 22

à détecter la présence de contaminants dans l’échantillon

Question 23

Comment interprete-t-on les résultats d’une courbe de dissociation pour un RT-qPCR

Answer 23

Chaque pic correspond à un produit amplifié.

La présence de 2 ou plus pics démontre donc qu’il y a un contaminant

Question 24

qu’est ce qu’on retrouve sur une puce à ADN?

Answer 24

Tout les gènes qu’on souhaite analyser dans les échantillons

Question 25

La puce à ADN analyse combien d’échantillons en même temps. pourquoi ne peut on pas en analyser plus?

Answer 25

2. la puce à ADN sert à comparer l’expression dans deux échantillons. on ne peut donc pas comparer plus de deux échantillons l’un contre l’autre

Question 26

Quel marquage est utilisé dans une puce à ADN. ou ce trouvent ces marqueurs

Answer 26

Des fluorophores qui se trouvent sur l’ADNc des échantillons

Question 27

quelles sont les principales limitations des puces à ADN

Answer 27

1: le signal fluorescent n’est plus linéaire à certaines concentrations d’ADN
2: on ne peut pas analyser des molécules dont la séquence est inconnu avant l’experience

Question 28

en quoi le RNA-seq est il semblable à la puce à ADN?

Answer 28

Le RNA-seq compare aussi l’ARN d’une population en comparaison avec une banque de gènes
Chez la puce à ADN, on hybride l’échantillon sur des gènes
Chez le RNA-seq, on séquence et aligne l’ARN sur le génome de l’organisme

Question 29

pourquoi est il nécessaire de se débarasser de l’ARN ribosomal dans le RNA-seq

Answer 29

puisque l’ARNr est en grande majorité dans l’ARNtotal, il serait du gaspillage de séquencer tout l’échantillon s’il contient majoritairement l’ARNr

Question 30

Comment fait on pour éviter le séquencage l’ARNr lors d’une expérience de RNA-seq

Answer 30

option 1: on sélecte les ARNm avec leur queue poly-A que l’on ne retrouve pas chez les arnr
option 2: on hybride les ARNr pour les retirer de l’échantillon

Question 31

existe-t-il des kit commerciaux pour retirer l’ARNm d’un échantillon? Comment fonctionne cette méthode

Answer 31

Oui, MICROBExpress etRibo-zero sont des kit commerciaux qui servent à retirer l’ARNm d’un échantillon puis celui-ci peut être retiré du mélange à l’aide d’un aimant.

Question 32

Comment déplètent-on l’ARNr par utilisation d’une nucléase spécifique aux molécules double-brin?

Answer 32

l’ADNc est dénaturé pui renaturé en présence de la nucléase qui élimine l’ADN double brin
Les ADN qui vont s’hybrider les plus rapidement sont ceux qui sont le plus abondants

Question 33

que veut dire l’acronyme FPKM et dans quelle technique applique t-on cette mesure

Answer 33

Fragment Per Kilobase per Million mapped reads

On s’en sert dans les expérience de RNA-Seq pour mettre en relation la quantité

Question 34

Pourquoi peut on analyser des ARN inconnus avec le RNA-seq mais pas avec la puce à ADN

Answer 34

Parce que le RNA-seq compare les séquences d’ARN au génome tandis que la puce compare avec des séquences nucléiques sur la puce.

Question 35

comment peut on détecter le sens d’un transcrit avec le RNA-seq?

Answer 35

des dUTP sont ajoutés pour faire le brin complémentaire à l’ARN. Ces dUTP permettent la destruction du brin par l’enzyme Uracil-N-glycosylase.
Il reste ensuite seulement le brin d’ADN complémentaire original (complémentaire à l’ARNm)
Les amorces uniques en 5’ et 3’ permettent de séquencer le brin dans un sens ou dans l’autre

Question 36

Comment se faisait le séquencage de protéines par la dégradation d’Edman

Answer 36

Le résidu N-terminal était retiré de la protéine à l’aide du PITC pui on pouvait analyser l’identité de ce résidu par séparation HPLC
Le cycle de dégradation était répété pour chaque résidu

Question 37

combien d’acides aminés pouvaient être séquencés par la dégradation d’Edman, comment pouvait-on dépasser cette limite

Answer 37

40-50 résidus. pour aller plus loin, on devait dégrader la protéines en plus petits morceaux, séquencer chaque morceau puis assembler les séquences ensemble pour obtenir la protéine native

Question 38

quelle est la méthode moderne pour séquencer des protéines?

Answer 38

la spectrométrie de masse

Question 39

quelle enzyme est utilisée pour digérer les protéines pour une analyse au spectromètre de masse

Answer 39

la tripsine

Question 40

comment analyse-t-on le spectre de masse d’une protéine suite à la digestion à la tripsine

Answer 40

On compare le spectre à une banque de donnée

Question 41

peut on quantifier les protéines par la spéctrométrie de masse?
Si oui, comment?

Answer 41

théoriquement, oui mais c’est très difficile

on peut normaliser par rapport aux autres protéines dans l’échantillon avec des standards internes connu

Question 42

comment peut on comparer l’abondance relative de peptides provenant de deux échantillons avec une méthode par spectrométrie de masse

Answer 42

on marque les peptides d’un échantillon avec de ‘Arginine ‘‘lourde’’ et l’autre échantillon avec de l’arginine ‘‘légère’’
Il y aura donc un légère différence de masse entre les peptides des deux échantillons et on pourra comparer les échantillons