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TSB400 > module 3: interactome > Flashcards

module 3: interactome Flashcards

1
Q

quels sont les 5 types d’intéractions protéines-protéines?

A 
Constitutive
Stables
Moyenne
Transitoires
Instantanées
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Q

quelles sont les étapes ‘‘old school’’ de purification de complexe protéique

A 
Lyse cellulaire
Extraction
Précipitation différentielle
Chromatographie
Électrophorèse
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3
Q

Quels sont les désavantages de la méthode d’analyse biochimique old school?

A

très difficile à réaliser
Requiert énormément de matière biologique
Chaque protéine/complexe possède sa propre technique de purification
Empêche une approche systématique/universelle
Détection préférentielle d’intéractions stables et abondantes

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4
Q

quels types de cellules combine-t-on pour créer des hybridomes qui expriment des anticorps monoclonaux?

A

Des cellules de myélomes et des cellules de rates d’un animal immunisé

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Q

comment fonctionne l’immunoprécipitation?

A

on utilise un AC spécifique à une protéine pour isoler cette protéine de la solution

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6
Q

quelle est la différence entre immunoprécipitation et co-immunoprécipitation

A

Dans la co-immunoprécipitation, isoler une protéine particulière permet aussi d’isoler le complexe protéique dont elle fait partie

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7
Q

quelles sont les deux matrices auxquelles on attache les anticorps pour précipiter les protéines lors d’une immunoprécipitation?
Comment sont elles précipitées?

A

Bille d’agarose séparée par centrifugation

Billes magnétiques: séparé à l’aide d’un aimant

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8
Q

quelles sont les méthode de détection/identification des protéines isolées dans une immunoprécipitation?

A

SDS-PAGE
Western Blot
Spectrométrie de masse

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9
Q

quelles sont les avantages de l’analyse par immunoprécipitation?

A

Étudie les interction dans des extraits in vivo
Purification spécifique
Grande sensibilité dépendament de la méthode de détection

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10
Q

Quelles sont les inconvénients de l’analyse par immunoprécipitation

A

Requiert un anticorps spécifique
Ne permet pas de déduire si une interaction est directe ou indirecte
Ne permet peu/pas de détecter des intéractions faibles entres protéines
l’exposition de l’épitope spécifique à l’anticorps peu être inneficace in vivo
Les contrôles sont nécessaires afin de valider les données obtenues

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11
Q

pourquoi dit on que l’ajout d’étiquettes d’affinité est une approche moderne d’analyse biochimique?

A

La présence d’étiquettes permet faire des isolations globales des protéines d’un mélange

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12
Q

qu’est ce qui influence la pose d’une étiquette en N ou C terminal d’une protéine?

A

La fonction d’une protéine peut être influencée de facon plus importante par sa portion C ou N terminale

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13
Q

en quoi consiste les approches modernes de précipitation des protéines

A

On ajoute des étiquettes sur la protéine d’interêt par génie génétique puis on peut précipité l’entièreté des protéines taggé ainsi que leur complexe avec un anticorps contre le tag ou un substrat/substance qui a de l’affinité pour le tag

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14
Q

comment s’appel la méthode de purification de protéines avec des étiquettes d’affinité

A

Pull-down

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15
Q

Quels sont les avantages de la méthode pull-down

A

Peut être utilisé avec presque n’importe quelle protéine
Le protocol d’extraction est simple
Possibilité de déterminer des interaction directes (gràce à une méthode in vitro utilisant des composants purifiés)

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16
Q

Quels sont les inconvénients du pull-down

A

Présence d’une étiquette qui pose un risque de dénaturation
Requiert la préparation de gènes fusions
Détecte peu/pas les intéractions faibles entres protéines
Le repliment in-vitro des protéines peut être différent
Purification ‘‘sales’’. la pureté des produits isolé n’est pas idéale

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17
Q

Pourquoi la méthode pull down permet elle de déterminer des intéractions directes mais pas la méthode old school?

A

La méthode old school utilise des extraits de cellules lysées. On a donc pas de control sur les protéines qui se retrouvent dans l’extrait.
La méthode pull-down peut se faire in-vitro avec seulement deux protéines et ainsi vérifier une intéraction directes entre celles-ci

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18
Q

de quoi est composé l’étiquette TAP. à quoi servent ces composantes

A

Protéine A qui a une affinité pour des IgG
Site de clivage de la proéase TEV (pour cliver la protéine du tag)
Un calmodulin binding peptide (qui permet une deuxième purification en présence de calcium)

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19
Q

quel est l’avantage du tag TAP par rapport au pull down classique?

A

permet un haut degré de purification
Possibilité d’élution douce, donc de faire des essais enzymatiques
Peut être facilement couplé à la spectro de masse

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20
Q

L’étiquette TAP permet elle de détecter des intéractions faibles entres protéines?

A

non

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21
Q

comment fonctionne la méthode d’isolation BioID

A

La protéine est fusionnée à BirA, une protéine qui ajoute des groupement biotine.
Toutes les protéines qui se trouve à proximité de l’enzyme BirA sont biotinylées, et peuvent ensuite être isolée à l’aide de la streptavidine

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22
Q

quels sont les avantages de la méthode BioID

A

peut être utilisé sur n’importe quelle protéine
Peut être exercée in vivo
Haute sensibilité, peut détecter des intéractions transitoires tant qu’elles sont dans le range de biotinylation de l’enzyme
Peut être couplé à la spectro de masse pour identifier des complexes
Fonctionne sur des complexes insolubles

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23
Q

Pourquoi est ce que l’isolation de complexes insolubles est difficile à réaliser?

A

Les complexes insolubles sont très difficile à purifier de manière biochimique. Il est donc très difficile de pouvoir démontrer une intéraction entre protéines puisqu’il est difficile de purifier celles-ci sans les dénaturer

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24
Q

Quels sont les inconvénients de la méthode BioID

A

La détection se fait par proximité. Il y a donc un risque de faux-positifs ou de détecter des protéines qui sont proches mais n’intéragissent pas
Présence d’une enzyme sur la protéine appât qui augmente le risque de dénaturation

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25
Q

Coment fonctionne la méthode FRET

A

les deux protéines étudiées sont taggé avec des fluorophores. L’émission du premier est capable d’exciter le deuxième
Si les protéines intéragissent, il va y avoir fluorescence du deuxième fluorophore. Sinon, Seulement le premier emettra de la lumière

26
Q

quels sont les avantages à la méthode FRET

A

Elle peut se faire in vitro ou in vivo
Cette méthode mesure des intérations directes puisqu’il faut une grande proximité pour qu’il y ait excitation du deuxième fluorophore
Grande sensibilité pour des intéractions rares ou protéines peu abondantes

27
Q

quels sont les inconvénients de la méthode FRET

A

il faut la mise au point des fusions du fluorophore aux protéines. Les fluorophores peuvent avoir une orientation non propice à provoquer une intéraction
Il y a une grande possiblité de faux-positifs

28
Q

Comment fonctionne la méthode SPR (Surface Plasmon Resonance)

A

Un laser frappe une plaque analytique et est réfléchi sur un détecteur. Le laser excite une couche d’électron, les plasmons, qui réagissent aux échantillons sur le coté opposé de la plaque.
Si les protéines qui sont du coté opposés de la plaque et y sont immobilisées intéragissent avec une protéine mobile qu’on ajoute, les plasmons devraient réagir à cette différence et provoquer un bande plus foncée sur le détecteur

29
Q

Quels sont les avantages de la méthode SPR

A

détection d’intéraction fortes à faibles, stables et transitoires
L’analyse par SPR donne aussi d’autres information comme les cinétiques d’intéractions, le Kd, Vmax et autres

30
Q

Quels sont les inconvénients de la méthode SPR

A

L’appareil est couteux et requiert une expertise particulière
Seulement appliquable pour des intéractions in vitro
Peu adapté pour des criblages, on a besoin d’une bonne connaissance des protéines qu’on analyse

31
Q

qu’est ce que la protéine Gal4 (indice: elle est liée à la méthode double hybride)

A

C’est un facteur de transcription de la levure. Dans une experience double hybride, elle est séparée en un domaine qui se lie à l’ADN et un domaine qui active la transcription

32
Q

Comment Gal4 est utilisé pour la méthode double hybride

A

Des protéines sont fusionnées au domaine activateur et au domaine de liaison. Si les protéines intéragissent ensemble, les deux domaines de gal4 vont être assez proche pour qu’il y ai transcription du gène en amont du point de liaison de Gal4
Dans une expérience double hybride, ce sera un gène rapporteur.

33
Q

Quelle modification génétique doit on faire à la souche de levure utilisée dans un double hybride pour s’assurer que l’expérience fonctionne

A

Inactiver le gène Gal4 endogène

34
Q

peut on quantifier/qualifier l’intéraction entre deux protéine avec une expérience de double hybride si celle-ci se révele positive

A

Non

35
Q

Quels sont les avantages de la méthode double-hybride

A 
Facile et rapide à faire
Cheap
in vivo
Presque n'importe quelle protéine
protéine de n'importe quel organisme
Pas besoin de purification
permet de cribler des banques
36
Q

Quels sont les inconvénients de la méthode double levure

A

Les intéractions peuvent être directes ou indirect.. pas certains
haut taux de faux positif/haut négatif
Pas d’information sur la stoechimétrie
Problème de repliement, de stabilité et pour l’analyse des protéines toxiques
on ne peut pas analyser des protéines activateurs ou répresseurs
La levure ne fait pas toutes les modifications post-traductionnelles retrouvées chez les eucaryotes (ex: glycosylation)
Taille limitée des protéines (Max 750 AA)

37
Q

à quoi sert la protéine MS2 qui est utilisée pour faire un triple hybride

A

MS2 est spécifique à un ARN variable. on utilise donc une protéine MS2 pour bind à un ARN qu’on souhaite étudier

38
Q

Le triple hybride sert à étudier l’intéraction entre deux molécules spécifiques. Pourquoi est il différent dans son fonctionnement du double hybride

A

Le triple hybride analyse une intéraction entre ARN et protéine.
La protéine est fusionnée comme dans le double hybride à la protéine Gal4
L’ARN est utilisé comme appat et doit être accroché sur l’hamecon (le complexe MS2/LexA)
Il y a donc 3 complexes important: Gal4 avec la protéine Y, L’ARN étudié et le complexe LexA-MS2

39
Q

une expérience triple hybride peut elle être utilisée pour vérifier une intéraction protéine-protéine?

A

non. le triple hybride est spécifiquement pour intéraction protéine-ARN

40
Q

Comment fonctionne l’approche EMSA ( gel shift)

A

On utilise un ADN connu analysé avec une protéine connue ou non purifiée à partir d’extraits.
En mettant l’ADN et la protéine sur gel, un intéraction entre la protéine et l’ADN devrait retarder la progression de l’ADN dans le gel

41
Q

en quoi consiste un super-shift dans une analyse EMSA

A

Un anticorps anti-protéine analysée couplé à une bille est ajouté au mélange ADN-Protéine.
Si les deux biomolécules intéragissent ensemble en présence de l’anticorps, il y aura un supershift plutot qu’un shift

42
Q

à la suite d’une analyse EMSA, on sait que la protéine X intéragit avec la séquence du gène AXO1. comment pourrait on cartographier la zone d’intéraction de la protéine X

A

utiliser une nucléase spécifique à la zone ou l’on suspecte l’intéraction. Si l’intéraction se fait bel et bien à cet endroit, la protéine X devrait protéger l’ADN de la coupure par la nucléase

43
Q

en quoi consiste un DNA pull-down

A

on fusionne l’ADN analysé à une étiquette de biotine. On accroche ensuite l’ADN à des billes on sont fix.es la de la streptavidine puis on expose ces billes à la protéine d’interêt.
On peut ensuite analyser le complexe par spectro de masse et voir si la protéine a été accroché par l’appât d’ADN

44
Q

Pourrait on analyser de l’ARN avec un DNA pull-down?

A

Oui

45
Q

Quels sont les avantages des méthodes de retardement sur gel et DNA pull-down?

A

Méthode simple peu couteuse

permet l’identification de partenaires d’intéractions (surtout dans le cas du DNA pull-down)

46
Q

quels sont les inconvénients des méthodes de retardement sur gel/DNA pulldown?

A

ils ne peuvent détecter que des intéraction stables
Les protéines doivent être abondantes pour être détectées
Haut risque de faux-positif

47
Q

Quelle puit controle est absolument essentiel `la méthode EMSA (retardement sur gel) pour observer une intéraction entre ADN et protéine?

A

Le puit controle avec l’ADN incubé sans la protéine.

48
Q

comment fonctionne l’analyse par méthode SELEX

A

on utilise une protéine étiquetée purifiée sur colonne et l’exposer à des fragments d’ADN générés aléatoirement. Les fragment d’ADN qui restent dans la colonne sont amplifiées par PCR et séquencées

49
Q

quels sont les avantages de la méthode SELEX

A

permet l’identification d’ADN optimal pour une protéine spécifique
méthode très sensible
Utile pour des protéines orphelines possédant un domaine de liaison à l’ADN

50
Q

quels sont les inconvénients de la méthode SELEX

A

les protéines sont recombinantes et ne sont donc pas nécessairement dans une conformation qu’on retrouve in vivo
Les séquences d’ADN sont artificielles
Les résultats de l’expérience demandent plus d’expérience/analyse génomique pour être validés

51
Q

Comment fonctionne la méthode d’analyse simple hybride?

A

On fusione la protéine d’interêt sur la région d’activation d’un facteur de transcription
On remplace aussi la séquence en amont du gène rapporteur par la séquence d’ADN qu’on souhaite étudier
Si l’ADN se lie à la protéine, il y a transcription du gène rapporteur

52
Q

y a t’il des avantages/inconvénients spécifique à la méthode simple hybride par rapport au double/triple hybride?

A

non. Les avantages/inconvénients sont identique.

53
Q

Comment fonctionne le ChIP

A

l’ADN est incubé avec les protéines étudies. L’état de l’échantillon est fixé au formaldéhyde. On fragmente l’échantillon d’ADN par sonication puis on utilise un anticorps anti-protéine d’interêt pour immunoprécipiter les segments d’ADN ou la protéine d’interêt intéragit

54
Q

quelle est la différence entre un ChIP-seq et un ChIP-exo? lequel est le plus précis pour l’identification de fragments d’ADN qui bind des protéines?

A

Chip exo utilise des exonucléases pour cliver les portions du brin autour de l’intéraction protéine-ADN.
Il ne reste donc seulement que la portion auquelle la protéine s’attache.

55
Q

quel intéraction spécifique tente-t-on d’identifier quand on chercher des intéraction ADN-ADN

A

des segments d’ADN qui sont éloignés dans le génome mais qui physiquement se raprochent dans le génome pour intéragir.
Ces segments peuvent être des promoteurs/activateurs/inhibiteurs de transcriptions

56
Q

à quoi sert le formaldéhyde dans la méthode ChIP-seq et les expérience d’intéractions ADN-ADN

A

à fixer les protéines-ADN ou l’intéraction ADN-ADN dans son état d’intéraction pour qu’on puisse y faire des manipulations sans que ces molécules se séparent

57
Q

Comment analyse-t-on les intéractions de l’ADN par la méthode 3C (1 région vs 1 région)

A

on fixe les intéraction au formaldéhyde puis on coupe l’ADN en petit morceau par enzyme de restriction qui laissent des bout cohésifs
Les fragments non liés vont donc se circulariser. L’intéraction d’ADN ne devrait pas tout le temps être circulaire mais devrait être ligué
On peu ensuite renverser la fixation de l’intéraction et séquencer le brin d’ADN avec des amorces ciblées sur les régions d’intérêt

58
Q

quelle est la différence entre l’analyse d’intéractions ADN-ADN 4c et 3c?

A

3c cherche à vérifier si une région spécifique intéragit avec une autre région spécifique
4c compare une région spécifique à tout l’ADN auquel la région est exposée

59
Q

Quelle est la différence de manipulation entre la méthode d’analyse 4C et 3C?

A

Les amorces utilisées pour séquencer la zone d’intéraction sont uniquement sur l’ADN connu et pourra amplifier une séquence à condition que l’ADN ait intéragit avec une autre région et se soit circularisé

60
Q

qu’est ce que la méthode Hi-C

A

C’est une expérience similaire à l’analyse 5C mais qui utilise des nucléotides biotinylés pour permettre l’utilisation de différentes enzymes de restriction/bris d’ADN par sonification et rendre l’analyse plus sensible

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