Module 5: mutagénèse Flashcards
qu’est ce que la mutagénèse aléatoire et donner des techniques pour effectuer celle-ci
Ajouter des mutations aléatoires dans une molécule d’ADN
par radiation/produit chimiques ou UV
Qu’est ce que la mutagénèse dirigée et donner des techniques pour effectuer celle-ci
Ajouter des mutations à un site particulier par approches de biologie moléculaire
quels sont les types de mutagénèse
délétion
Insertion
Substitution
qu’est ce qu’une mutation:
missense
Nonsense
Silent
Missense: changement d’un AA
nonsense: terminaison précoce
Silent: mutation de change pas l’acide aminé
Comment fait on une mutagénèse dirigée par PCR
on créer une amorce de PCR qui s’hybride de part et d’autre du site de mutation. le centre de l’amorce contient la mutation qui sera inséré par substitution/insertion/délétion
Quelle est la limite de la mutagénèse dirigée par PCR?
seulement efficace pour des courtes substitutions/déletions
par quelle technique peut on joindre deux brins d’ADN différent en un seul brin?
PCR fusion
Comment peut on faire des modifications à des plasmides complèts par PCR. Décriver une substitution, deletion et insertions
On amplifie le plasmide avec des amorces qui partent des deux cotés d’un ‘‘point d’insertion.
Substitution: les substitutions seront dans les amorces de PCR
délétion. le point d’insertion est le site de délétion. Les amorces amplifient seulement en dehors du site de délétion
insertion: les nucléotides à insérés sont en 5’ d’une ou deux des amorces
pourquoi les amorces de PCR pour mutagénèse dans un plasmide doivent être phosphorylées
Pour mettre au plasmide de se cirulariser après l’amplification
Comment utilise-t-on la méthylation de l’ADN pour éviter les faux-positifs dans une mutagénèse de plasmide complet?
Le plasmide original est méthylé. Le fragment nouvellement synthétisé avec les amorces de mutagénèse ne sera pas méthylé.
On utilise une enzyme de restriction qui reconnait l’ADN méthylé. Cette enzyme va détruire les brins originaux mais pas les brins mutés
quels sont les nucléotides qui doivent être 100% homologues lors de la conception d’amorces de PCR
au moins 10 nucléotides en 3’ de l’amorce
pourquoi la TAQ n’est pas idéale pour faire de la mutagénèse par PCR
Elle n’a pas d’activié correctrice et a l’activité terminale transférase. Une mutagénèse par PCR doit laisser des bouts francs
en quoi consiste le PCA (polymerase cycling assembly)
on utilise des oligonucléotides avec des régions de chevauchement ainsi que des amorces externes qui deviendront les extrémités du fragment final
Les cycles de PCR devrait permettre d’assembler les fragments chevauchants ensembles et de faire des brins entiers gràce aux amorces externes
comment fonctionne la mutagénèse dirigée par recombinaison homologue
une coupure sur un brin entraine la réparation du brin à l’aide d’un autre brin homologue.
On fournit donc à un ADN cible un ADN homologue dans lequel on retrouve une cassette d’insertion.
après le bris de l’ADN cible, l’ADN homologue va être utilisé pour réparer le bris et devrait laissé la cassette d’insertion dans l’ADN cible
pourquoi la recombinaison homologue est plus efficace dans la levure pour faire la mutagénèse dirigée?
Les autres organismes tendent à insérer la cassette à des endroits aléatoires plutot qu’au site d’homologie. La recombinaison homologue fait plus de mutagénèse aléatoire chez les eucaryotes autres que la levure
