module 6: transformation génétique d'eucaryotes

Question 1

quels sont les deux types de cellules humaines qu’on culture?

Answer 1

cultures primaires/secondaire de tissus normaux

Culture de cellules immortelles

Question 2

quelle est la différence entre des cultures primaires et secondaires de tissus sain?

Answer 2

les cultures secondaires peuvent être propagées puisqu’elles se divisent bien in-vitro, ce qui n’est pas le cas des cultures primaires qui peuvent petre maintenues en cultures mais qui ne survivent pas longtemps in-vitro

Question 3

Si les cultures secondaires peuvent se diviser, quelle est la différence entre des cultures secondaires et les lignées immortelles

Answer 3

les cultures secondaires finissent par tomber en sénescence après un certains nombre de division tandis que les cellules immortelles continuent de se diviser indéfiniment

Question 4

quelles sont les 4 méthode d’insertion d’ADN dans des cellules eucaryotes

Answer 4

Transfection
Infection
Électroporation
micro-injection

Question 5

Comment fonctionne la transfection d’ADN?

Answer 5

l’ADN est introduit en combinaison avec des précipités de sels ou sont insérés à l’intérieur de liposomes qui seront internalisé par les cellules

Question 6

comment se fait le transfert d’ADN par infection?

Answer 6

on utilise des rétrovirus modifiés génétiquement pour donner un AND spécifique

Question 7

Comment fonctionne l’électroporation?

Answer 7

les mécanismes sont peu connus mais le passage d’un courant électrique permet l’incorporation d’ADN dans des cellules

Question 8

pourquoi faut il des milieux dépourvus de sels pour faire une électroporation?

Answer 8

une trop bonne conduction du milieu cause des arcs électrique et grille les cellules

Question 9

comment applique-t-on la micro-injection et dans quel contexte utilise-t-on cette méthode

Answer 9

on utilise une seringue microscopique pour injecter l’ADN directement dans le noyau des cellules
Cette méthode est surtout réservée pour la fécondation in-vitro

Question 10

qu’est ce qui rend l’expression d’un plasmide transitoire?

Answer 10

les plasmides qu’on intègre dans une cellule ne sont pas répliqués. Le plasmide finit donc par être perdu

Question 11

comment peut on cribler les cellules transformées de facon stable?

Answer 11

on créer des lignées qui continuent d’exprimer le gène rapporteur après une longue période de temps (semaines)

Question 12

est ce qu’on peut diriger l’insertion d’ADN dans le génome avec la transfection?

Answer 12

non, c’est une intégration aléatoire

Question 13

comment s’assure-t-on que les virus utilisés pour le transfert d’ADN ne cause pas d’épidémie?

Answer 13

on retire leur capacité de se propager, il n’ont plus de cpacité à s’encapsider.

Question 14

quel type de virus utilise-t-on pour insérer de l’ADN dans des cellules?

Answer 14

des lentivirus, une famille de rétrovirus

Question 15

à quoi servent les cellules d’empacktage pour la transformation de cellules avec un virus modifié

Answer 15

Ces cellules possèdent les gènes de capsules virales, ils permettent de produire une énorme quantité de virus pour infecter d’autres cellules sans que les virions soit capable de se propager dans les autres cellules cibles

Question 16

Pourquoi voudrait on transférer des gènes d’empacktage dans un plasmide différent de celui qui code pour l’Enveloppe du virus dans les cellules d’empacktage?

Answer 16

pour éviter les chances que le virus absorbe cet ADN et redevienne infectieux

Question 17

quels avantage l’infection lentivirale a-t-il au dessus de la transfection

Answer 17

Plus efficace que la transfection
Capaciter d’infecter des cellules qui ne se divisent pas activement
Permet de cibler des cellules précises avec le tropisme du virus utilisé

Question 18

à quoi sert la manipulation génétique des cellules?

Answer 18

surexprimer un gène ou supprimer l’expression de celui-ci par knock-down ou knock out

Question 19

en quoi consiste le système Tet

Answer 19

Tet est un récepteur qui répond à la tétracycline et qui se lie à un opérateur dans l’ADN. on créer une protéine fusion TetRecepteur à VP16, une protéine d’activation transcriptionelle.
L’exposition à l tétracycline/doxycicline permet le controle de l’expression du gène

Question 20

Quelle est la différence entre Tet-on et Tet-off comment a-t-on créer ces deux variations

Answer 20

Tet off allume le gène quand il n’y a pas de tétracycline dans le milieu
Tet on allume le gène quand il y a tétracycline dans le millieu
Tet on a été créer en ajoutant une mutation sur le récepteur à la tétracycline qui renverse son activation

Question 21

Comment change-t-on une cellule pour surexprimer un gène?

Answer 21

on ajoute le même gène avec un promoteur fort.

on peut ignorer le gène endogène

Question 22

quels sont les différences au niveau fonctionnel entre les knock-down et les knock-out?

Answer 22

un knock out retire le gène/un exon important du gène pour l’inactiver alors que le knock down cible les ARNm pour réduire la traduction de ce gène

Question 23

à quoi sert les mécanismes endogènes d’ARNsi chez des cellules eucaryote? Comment fonctionnent-ils?

Answer 23

à la défence contre les infections virales, L’ARNsi et ses enzymes reconnaissent l’ARNdouble brin comme un signe d’infection virale et va utiliser cette séquence d’ARN pour détruire les ARNm qui ont la même séquences

Question 24

combien de nucléotides forment les petits ARN interférants?

Answer 24

21 à 23

Question 25

expliquer le fonctionnement des enzymes qui permettent d’accomplir l’inhibition post traductionnelle par ARNsi

Answer 25

Protéine Dicer clive l’ARN double brin
association de l’ARN clivé à un complexe RISC par la protéine argonaute
L’ARN guide le complexe RISC et permet de cliver les ARN homologue à celui utilisé

Question 26

quelles sont les deux manière d’induire une réponser par ARNi dans une cellule?

Answer 26

synthèse et transfection d’ARN double brin avec liposomes
Construction et transfection/infection d’un ADN qui code pour un ARN qui va se replier en tige boucle et donner une séquence d’ARN double brin assez longue pour Dicer

Question 27

comment peut on à la fois générer le knock out d’un gène et cribler les cellules transformées par une seule modification?

Answer 27

Introduire un gène de sélection dans le milieu d’un exon du gène, ce qui devrait empêcher l’expression du gène et la remplacer par le gène rapporteur

Question 28

Comment peut on éliminer les transformation knock-out qui se sont fait par insertion au hasard dans le génome?

Answer 28

par l’ajout d’un marqueur de sélection négative (gène toxique) à l’extérieur de la casette d’insertion et des régions homologues du gène cible

Question 29

comment peut on étudier des knock out de gènes essentiels?

Answer 29

on fait des knock out qui sont inductibles

Question 30

comment fonctionne le système Cre-Lox pour faire un knock out inductible?

Answer 30

Lox sont des séquences qui peuvent être excisé de l’ADN lorsqu’ils sont mis en contact avec la Cre. on met des segments Lox en amont et aval de l’exon qu’on souhaite exciser pour faire le knock out.
Lorsqu’on ajoute la Cre, l’ADN qui se trouve entre les segments Lox est excisé.

Question 31

comment fait on un système Cre-recombinase tissu spécifique?

Answer 31

on ajoute le système CreLox dans l’organisme mais le gène de la Cre est en aval d’un promoteur tissu spécifique. La Cre est donc seulement exprimée dans le tissu, ce qui cause le knock out seulement dans ce tissu ciblé

Question 32

on commande une souris qui exprime la Cre-recombinase dans le coeur. Comment obtient on une souris knockout pour un gène dans le coeur?

Answer 32

On croise la souris Cre-recombinante avec une souris qui possède l’allèle Floxé (l’allèle avec les séquences Lox en amont/aval d’un exon)
La F1 devrait avoir des individus qui possèdent les deux mutations

Question 33

Comment créer-t-on une Cre recombinase inductible?

Answer 33

On créer une protéine fusion Cre-récepteur à des stéroides. Cette modification rend la Cre inactive tant qu’elle n’est pas en contact avec son ligand