module 6: transformation génétique d'eucaryotes Flashcards
quels sont les deux types de cellules humaines qu’on culture?
cultures primaires/secondaire de tissus normaux
Culture de cellules immortelles
quelle est la différence entre des cultures primaires et secondaires de tissus sain?
les cultures secondaires peuvent être propagées puisqu’elles se divisent bien in-vitro, ce qui n’est pas le cas des cultures primaires qui peuvent petre maintenues en cultures mais qui ne survivent pas longtemps in-vitro
Si les cultures secondaires peuvent se diviser, quelle est la différence entre des cultures secondaires et les lignées immortelles
les cultures secondaires finissent par tomber en sénescence après un certains nombre de division tandis que les cellules immortelles continuent de se diviser indéfiniment
quelles sont les 4 méthode d’insertion d’ADN dans des cellules eucaryotes
Transfection
Infection
Électroporation
micro-injection
Comment fonctionne la transfection d’ADN?
l’ADN est introduit en combinaison avec des précipités de sels ou sont insérés à l’intérieur de liposomes qui seront internalisé par les cellules
comment se fait le transfert d’ADN par infection?
on utilise des rétrovirus modifiés génétiquement pour donner un AND spécifique
Comment fonctionne l’électroporation?
les mécanismes sont peu connus mais le passage d’un courant électrique permet l’incorporation d’ADN dans des cellules
pourquoi faut il des milieux dépourvus de sels pour faire une électroporation?
une trop bonne conduction du milieu cause des arcs électrique et grille les cellules
comment applique-t-on la micro-injection et dans quel contexte utilise-t-on cette méthode
on utilise une seringue microscopique pour injecter l’ADN directement dans le noyau des cellules
Cette méthode est surtout réservée pour la fécondation in-vitro
qu’est ce qui rend l’expression d’un plasmide transitoire?
les plasmides qu’on intègre dans une cellule ne sont pas répliqués. Le plasmide finit donc par être perdu
comment peut on cribler les cellules transformées de facon stable?
on créer des lignées qui continuent d’exprimer le gène rapporteur après une longue période de temps (semaines)
est ce qu’on peut diriger l’insertion d’ADN dans le génome avec la transfection?
non, c’est une intégration aléatoire
comment s’assure-t-on que les virus utilisés pour le transfert d’ADN ne cause pas d’épidémie?
on retire leur capacité de se propager, il n’ont plus de cpacité à s’encapsider.
quel type de virus utilise-t-on pour insérer de l’ADN dans des cellules?
des lentivirus, une famille de rétrovirus
à quoi servent les cellules d’empacktage pour la transformation de cellules avec un virus modifié
Ces cellules possèdent les gènes de capsules virales, ils permettent de produire une énorme quantité de virus pour infecter d’autres cellules sans que les virions soit capable de se propager dans les autres cellules cibles
Pourquoi voudrait on transférer des gènes d’empacktage dans un plasmide différent de celui qui code pour l’Enveloppe du virus dans les cellules d’empacktage?
pour éviter les chances que le virus absorbe cet ADN et redevienne infectieux
quels avantage l’infection lentivirale a-t-il au dessus de la transfection
Plus efficace que la transfection
Capaciter d’infecter des cellules qui ne se divisent pas activement
Permet de cibler des cellules précises avec le tropisme du virus utilisé
à quoi sert la manipulation génétique des cellules?
surexprimer un gène ou supprimer l’expression de celui-ci par knock-down ou knock out
en quoi consiste le système Tet
Tet est un récepteur qui répond à la tétracycline et qui se lie à un opérateur dans l’ADN. on créer une protéine fusion TetRecepteur à VP16, une protéine d’activation transcriptionelle.
L’exposition à l tétracycline/doxycicline permet le controle de l’expression du gène
Quelle est la différence entre Tet-on et Tet-off comment a-t-on créer ces deux variations
Tet off allume le gène quand il n’y a pas de tétracycline dans le milieu
Tet on allume le gène quand il y a tétracycline dans le millieu
Tet on a été créer en ajoutant une mutation sur le récepteur à la tétracycline qui renverse son activation
Comment change-t-on une cellule pour surexprimer un gène?
on ajoute le même gène avec un promoteur fort.
on peut ignorer le gène endogène
quels sont les différences au niveau fonctionnel entre les knock-down et les knock-out?
un knock out retire le gène/un exon important du gène pour l’inactiver alors que le knock down cible les ARNm pour réduire la traduction de ce gène
à quoi sert les mécanismes endogènes d’ARNsi chez des cellules eucaryote? Comment fonctionnent-ils?
à la défence contre les infections virales, L’ARNsi et ses enzymes reconnaissent l’ARNdouble brin comme un signe d’infection virale et va utiliser cette séquence d’ARN pour détruire les ARNm qui ont la même séquences
combien de nucléotides forment les petits ARN interférants?
21 à 23
expliquer le fonctionnement des enzymes qui permettent d’accomplir l’inhibition post traductionnelle par ARNsi
Protéine Dicer clive l’ARN double brin
association de l’ARN clivé à un complexe RISC par la protéine argonaute
L’ARN guide le complexe RISC et permet de cliver les ARN homologue à celui utilisé
quelles sont les deux manière d’induire une réponser par ARNi dans une cellule?
synthèse et transfection d’ARN double brin avec liposomes
Construction et transfection/infection d’un ADN qui code pour un ARN qui va se replier en tige boucle et donner une séquence d’ARN double brin assez longue pour Dicer
comment peut on à la fois générer le knock out d’un gène et cribler les cellules transformées par une seule modification?
Introduire un gène de sélection dans le milieu d’un exon du gène, ce qui devrait empêcher l’expression du gène et la remplacer par le gène rapporteur
Comment peut on éliminer les transformation knock-out qui se sont fait par insertion au hasard dans le génome?
par l’ajout d’un marqueur de sélection négative (gène toxique) à l’extérieur de la casette d’insertion et des régions homologues du gène cible
comment peut on étudier des knock out de gènes essentiels?
on fait des knock out qui sont inductibles
comment fonctionne le système Cre-Lox pour faire un knock out inductible?
Lox sont des séquences qui peuvent être excisé de l’ADN lorsqu’ils sont mis en contact avec la Cre. on met des segments Lox en amont et aval de l’exon qu’on souhaite exciser pour faire le knock out.
Lorsqu’on ajoute la Cre, l’ADN qui se trouve entre les segments Lox est excisé.
comment fait on un système Cre-recombinase tissu spécifique?
on ajoute le système CreLox dans l’organisme mais le gène de la Cre est en aval d’un promoteur tissu spécifique. La Cre est donc seulement exprimée dans le tissu, ce qui cause le knock out seulement dans ce tissu ciblé
on commande une souris qui exprime la Cre-recombinase dans le coeur. Comment obtient on une souris knockout pour un gène dans le coeur?
On croise la souris Cre-recombinante avec une souris qui possède l’allèle Floxé (l’allèle avec les séquences Lox en amont/aval d’un exon)
La F1 devrait avoir des individus qui possèdent les deux mutations
Comment créer-t-on une Cre recombinase inductible?
On créer une protéine fusion Cre-récepteur à des stéroides. Cette modification rend la Cre inactive tant qu’elle n’est pas en contact avec son ligand
