module 4: clonage Flashcards
quels sont les composantes nécessaire à une réaction PCR?
tampon dNTPs Amorces Matrice d'ADN à amplifier Polymérase thermophile
quelles sont les 3 étapes répétées dans un PCR
la dénaturation
La rénaturation
L’élongation
classer en ordre croissant les étapes du pcr par leur température?
renaturation–>élongation–>dénaturation
qu’est ce qu’un 2 step PCR
un pcr ou l’on saute l’étpe d’élongation
Quels sont les conditions qui permettent de faire un 2 step PCR
Pourquoi chque condition permet le PCR 2 step
-amorces avec un Tm élevé (permet de faire l’élongation longtemps pendant le réchauffement de la température de ranaturation à la Tdénaturation
Produits de PCR courts permet de faire l’élongation rapidement
Polymérase rapide Permet de faire l’élongation rapidement
Un PCR traditionnel fait une amplification exponentielle, comment pourrait on faire une amplification linéaire?
en utilisant une seule amorce
quand est ce qu’on va utiliser des amorces longues ou courtes pour un PCR?
on va utiliser des amorces courtes si elles sont riche en GC et longues si riches en AT
qu’est ce qui résulte de l’amplification fait avec des amorces formant des structures secondaires stables?
il n’y a pas/peu d’amplification
qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybdridation trop faible?
l’hybridation se fait de manière non-spécifique
qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybridation trop élevée
Diminution de l’efficacité du PCR
Générallement, quelle tmepérature utilise-t-on comme température de renaturation?
Tm - 5 degrés
quelles sont les caractéristiques optimales pour une polymérase de PCR?
haute thermostabilité
taux de polymérisation rapide
Haute fidélité
Haute processivité
qu’est ce que l’activité 5’-3’ exonucléase?
dégradation de nucléotides qui se trouvent déjà sur le brin
Qu’est ce que l’activité 3’-5’ exonucléase
Activité correctrice de l’ADN synthétisé
quel est l’avantage d’utiliser une polymérase qui a l’activité 3’-5’ exonucléase
ces polymérases font moins d’erreur
qu’est ce que l’activité terminal transférase
La capacité d’ajouter un nucléotide additionnel à chaque extrémité de fragments
qu’est ce qui arrive si une polymérase à faible processivité décroche?
une autre polymérase va venir s’accrocher sur le brin et finir le travail
récemment, on a amélioré la polymérase TAQ avec un domaine Sso7d, quelle est la fonction de cette modification?
elle augmente la processivité de la taq
pourquoi n’utilise-t-on pas toujours les polymérase avec les meilleurs caractéristiques?
elles sont générallement plus dispendieuses
comment peut on optimiser un PCR qui fonctionne mal?
chagement du tampon (pH, ions Mg, additifs)
Optimisation de la température de renaturation
Changer la polymérase
changer les amorces
Comment fonctionne un gradient de température dans un PCR
Les tubes dans l’appareil ne sont pas tous à la même température.
Comment réalise-t-on la méthode ‘‘hot start’’ dans un PCR?
par séquestration de composantes essentielle au PCR (Mg ou polymérase)
Par ajout de groupements chimiques thermolabiles sur les amorces
Par inactivation de la pol par des Ac /pol mutante sensibles au froid
à quoi sert le ‘‘hot start’’
à empêcher la polymérisation d’hybridation non spécifique pendant le réchauffement du tube de PCR
Comment fonctionne la stratégie ‘‘touch down’’
Utilise une température de renaturation très élevée puis la déscendre à chaque cycle
qu’est ce que l’amplification isothermale par déplacement de brin
Réaction de PCR à 1 seule température
Permet de répliquer de l’ADN circulaire ou linéaire
Le déplacement de brin permet un facteur d’amplification élevé
qu’est ce qu’un lien phosphorothioates
un modification sur les groupements phosphates qui sont résistants à l’activité exonucléase
comment peut on vérifier qu’une colonie bactérienne a bien ingéré un plasmide qui contient l’insert lors d’un clonage moléculaire
Digestion du plasmide
Electrophorese
Vérifier la présence d’une bande pour l’insert
quelles sont les caractéristiques idéales d’un vecteur de clonage
peut être introduit dans l’hôte
Peut se répliquer dans l’hôte
Contient plusieurs sites de restriction uniques
Contient 1 ou + marqueurs de sélection
pourquoi le clonage moléculaire par PCR est il plus avantageux que les approches traditionnelles
cela élimine le besoin d’avoir des sites de restrictions sur le plasmide
Dans quel cas doit on procédé à une insertion directionnelles pour un clonage?
Si l’on clone une séquence codante ou le gène doit être inséré dans un sens spécifique
pourquoi est ce que les clonages à extrémités franches mène à des faux positifs?
Les vecteurs peuvent se refermer sur eux-même
Lors d’un clonage à extrémité franches, comment peut on empêcher les faux positifs qui n’ont pas l’insert
Mettre un marqueur de sélection négatif (gène toxique) qui sera interrompu par l’ajout de l’insert
comment l’activité terminale-transférase de la TAQ peut être utilisée pour un clonage?
On peut préparer des vecteurs ayant un bout cohésif composé d’un seul T. Le vecteur ne devrait pas se refermer sur lui-même
Comment fait on des PCR mutagénique
en utilisant des amorces qui ont un portion ‘‘hanging’’ qui n’est pas complémentaire à la matrice et qui contient la séquence à ajouter
quel risque est associé à l’ajout de nucléotides mutagéniques dans des amorces de PCR
L’allongement de l’amorce augmente les chances que l’amorce créer des structures secondaires
Lors de l’ajout d’un site de restriction au bout d’une amorce de PCR, peut on ajouter le site au bout 5’ ou 3’ terminal de l’amorce?
non, pour que l’enzyme puisse le cliver, il est idéal d’avoir au moins 6 nucléotides entre le site de restriction et le bout de l’amorce
qu’est ce qu’un PCR fusion, Donner un exemple d’usage du PCR fusion
un PCR qui fusionne deux protéines ensembles
On peut l’utiliser pour créer des protéines avec des Tags
qu’est ce qu’une enzyme de restriction de type 2S
une enzyme qui reconnait un site de restriction non-palindromique et clive à l’extérieur du site de restriction peu importe la séquence hors-site
en quoi consiste la méthode du ‘‘golden gate assembly’’
usage d’enzymes de restriction de type 2S pour fusion un grand nombre de gènes sans laisser de cicatrices de sites de restriction
quelles enzymes sont utilisées dans l’assemblage Gibson
5’ exonucléases,
ADN polymérases
ADN ligases
quel est l’avantage d’assembler des fragments de séquences in vitro plutot qu’in vivo? et vice versa?
In vitro est plus rapide
In vivo nécessite moins de manipulation enzymatiques couteuses
qu’est ce que la biologie synthétique?
conception et construction de systèmes biologiques qu’on ne retrouve pas dans la nature
à quoi sert le ‘‘registry of standard biological parts’’
à standardiser les éléments de la biologie synthétiques fonctionnels,
Comme la standardisation des pièces mécaniques commes des vis/planches/etc
donner quelques exemples de parts qui peuvent se retrouver dans le registry of standard biological parts
2-3 exemples
Promoteurs ribosomes binding sites Coding sequences séquences terminatrices Vecteurs Gènes fonctionnels
