module 4: clonage

Question 1

quels sont les composantes nécessaire à une réaction PCR?

Answer 1

tampon
dNTPs
Amorces
Matrice d'ADN à amplifier
Polymérase thermophile

Question 2

quelles sont les 3 étapes répétées dans un PCR

Answer 2

la dénaturation
La rénaturation
L’élongation

Question 3

classer en ordre croissant les étapes du pcr par leur température?

Answer 3

renaturation–>élongation–>dénaturation

Question 4

qu’est ce qu’un 2 step PCR

Answer 4

un pcr ou l’on saute l’étpe d’élongation

Question 5

Quels sont les conditions qui permettent de faire un 2 step PCR
Pourquoi chque condition permet le PCR 2 step

Answer 5

-amorces avec un Tm élevé (permet de faire l’élongation longtemps pendant le réchauffement de la température de ranaturation à la Tdénaturation

Produits de PCR courts permet de faire l’élongation rapidement

Polymérase rapide Permet de faire l’élongation rapidement

Question 6

Un PCR traditionnel fait une amplification exponentielle, comment pourrait on faire une amplification linéaire?

Answer 6

en utilisant une seule amorce

Question 7

quand est ce qu’on va utiliser des amorces longues ou courtes pour un PCR?

Answer 7

on va utiliser des amorces courtes si elles sont riche en GC et longues si riches en AT

Question 8

qu’est ce qui résulte de l’amplification fait avec des amorces formant des structures secondaires stables?

Answer 8

il n’y a pas/peu d’amplification

Question 9

qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybdridation trop faible?

Answer 9

l’hybridation se fait de manière non-spécifique

Question 10

qu’est ce qui arrive si on fait un PCR avec une température d’hybridation trop élevée

Answer 10

Diminution de l’efficacité du PCR

Question 11

Générallement, quelle tmepérature utilise-t-on comme température de renaturation?

Answer 11

Tm - 5 degrés

Question 12

quelles sont les caractéristiques optimales pour une polymérase de PCR?

Answer 12

haute thermostabilité
taux de polymérisation rapide
Haute fidélité
Haute processivité

Question 13

qu’est ce que l’activité 5’-3’ exonucléase?

Answer 13

dégradation de nucléotides qui se trouvent déjà sur le brin

Question 14

Qu’est ce que l’activité 3’-5’ exonucléase

Answer 14

Activité correctrice de l’ADN synthétisé

Question 15

quel est l’avantage d’utiliser une polymérase qui a l’activité 3’-5’ exonucléase

Answer 15

ces polymérases font moins d’erreur

Question 16

qu’est ce que l’activité terminal transférase

Answer 16

La capacité d’ajouter un nucléotide additionnel à chaque extrémité de fragments

Question 17

qu’est ce qui arrive si une polymérase à faible processivité décroche?

Answer 17

une autre polymérase va venir s’accrocher sur le brin et finir le travail

Question 18

récemment, on a amélioré la polymérase TAQ avec un domaine Sso7d, quelle est la fonction de cette modification?

Answer 18

elle augmente la processivité de la taq

Question 19

pourquoi n’utilise-t-on pas toujours les polymérase avec les meilleurs caractéristiques?

Answer 19

elles sont générallement plus dispendieuses

Question 20

comment peut on optimiser un PCR qui fonctionne mal?

Answer 20

chagement du tampon (pH, ions Mg, additifs)
Optimisation de la température de renaturation
Changer la polymérase
changer les amorces

Question 21

Comment fonctionne un gradient de température dans un PCR

Answer 21

Les tubes dans l’appareil ne sont pas tous à la même température.

Question 22

Comment réalise-t-on la méthode ‘‘hot start’’ dans un PCR?

Answer 22

par séquestration de composantes essentielle au PCR (Mg ou polymérase)
Par ajout de groupements chimiques thermolabiles sur les amorces
Par inactivation de la pol par des Ac /pol mutante sensibles au froid

Question 23

à quoi sert le ‘‘hot start’’

Answer 23

à empêcher la polymérisation d’hybridation non spécifique pendant le réchauffement du tube de PCR

Question 24

Comment fonctionne la stratégie ‘‘touch down’’

Answer 24

Utilise une température de renaturation très élevée puis la déscendre à chaque cycle

Question 25

qu’est ce que l’amplification isothermale par déplacement de brin

Answer 25

Réaction de PCR à 1 seule température
Permet de répliquer de l’ADN circulaire ou linéaire
Le déplacement de brin permet un facteur d’amplification élevé

Question 26

qu’est ce qu’un lien phosphorothioates

Answer 26

un modification sur les groupements phosphates qui sont résistants à l’activité exonucléase

Question 27

comment peut on vérifier qu’une colonie bactérienne a bien ingéré un plasmide qui contient l’insert lors d’un clonage moléculaire

Answer 27

Digestion du plasmide
Electrophorese
Vérifier la présence d’une bande pour l’insert

Question 28

quelles sont les caractéristiques idéales d’un vecteur de clonage

Answer 28

peut être introduit dans l’hôte
Peut se répliquer dans l’hôte
Contient plusieurs sites de restriction uniques
Contient 1 ou + marqueurs de sélection

Question 29

pourquoi le clonage moléculaire par PCR est il plus avantageux que les approches traditionnelles

Answer 29

cela élimine le besoin d’avoir des sites de restrictions sur le plasmide

Question 30

Dans quel cas doit on procédé à une insertion directionnelles pour un clonage?

Answer 30

Si l’on clone une séquence codante ou le gène doit être inséré dans un sens spécifique

Question 31

pourquoi est ce que les clonages à extrémités franches mène à des faux positifs?

Answer 31

Les vecteurs peuvent se refermer sur eux-même

Question 32

Lors d’un clonage à extrémité franches, comment peut on empêcher les faux positifs qui n’ont pas l’insert

Answer 32

Mettre un marqueur de sélection négatif (gène toxique) qui sera interrompu par l’ajout de l’insert

Question 33

comment l’activité terminale-transférase de la TAQ peut être utilisée pour un clonage?

Answer 33

On peut préparer des vecteurs ayant un bout cohésif composé d’un seul T. Le vecteur ne devrait pas se refermer sur lui-même

Question 34

Comment fait on des PCR mutagénique

Answer 34

en utilisant des amorces qui ont un portion ‘‘hanging’’ qui n’est pas complémentaire à la matrice et qui contient la séquence à ajouter

Question 35

quel risque est associé à l’ajout de nucléotides mutagéniques dans des amorces de PCR

Answer 35

L’allongement de l’amorce augmente les chances que l’amorce créer des structures secondaires

Question 36

Lors de l’ajout d’un site de restriction au bout d’une amorce de PCR, peut on ajouter le site au bout 5’ ou 3’ terminal de l’amorce?

Answer 36

non, pour que l’enzyme puisse le cliver, il est idéal d’avoir au moins 6 nucléotides entre le site de restriction et le bout de l’amorce

Question 37

qu’est ce qu’un PCR fusion, Donner un exemple d’usage du PCR fusion

Answer 37

un PCR qui fusionne deux protéines ensembles

On peut l’utiliser pour créer des protéines avec des Tags

Question 38

qu’est ce qu’une enzyme de restriction de type 2S

Answer 38

une enzyme qui reconnait un site de restriction non-palindromique et clive à l’extérieur du site de restriction peu importe la séquence hors-site

Question 39

en quoi consiste la méthode du ‘‘golden gate assembly’’

Answer 39

usage d’enzymes de restriction de type 2S pour fusion un grand nombre de gènes sans laisser de cicatrices de sites de restriction

Question 40

quelles enzymes sont utilisées dans l’assemblage Gibson

Answer 40

5’ exonucléases,
ADN polymérases
ADN ligases

Question 41

quel est l’avantage d’assembler des fragments de séquences in vitro plutot qu’in vivo? et vice versa?

Answer 41

In vitro est plus rapide

In vivo nécessite moins de manipulation enzymatiques couteuses

Question 42

qu’est ce que la biologie synthétique?

Answer 42

conception et construction de systèmes biologiques qu’on ne retrouve pas dans la nature

Question 43

à quoi sert le ‘‘registry of standard biological parts’’

Answer 43

à standardiser les éléments de la biologie synthétiques fonctionnels,
Comme la standardisation des pièces mécaniques commes des vis/planches/etc

Question 44

donner quelques exemples de parts qui peuvent se retrouver dans le registry of standard biological parts
2-3 exemples

Answer 44

Promoteurs
ribosomes binding sites
Coding sequences
séquences terminatrices
Vecteurs
Gènes fonctionnels