Protocole I: Retardement sur gel Flashcards
Cette technique est utilisé pour quoi?
Détecter l’interaction d’une protéine avec l’ADN ou de l’ARN
Cette technique fonctionne comment (on compare quoi?)
Comparer la vitesse de migration d’un fragment d’ADN dans un gel natif à un champ électrique
Cette technique repose sur quoi? (la migration est comment?)
Que fait-on dans ce lab
un fragment d’ADN seul migre plus vite qu’un fragment complexé à des protéines
Ainsi, on migre de l’ADN simple et dans d’autre puits l’ADN en contact avec une protéine suceptible de s’y lier
Qu’observe-t-on si une protéine se lie à de l’ADN suite à l’électrophorèse?
un retard de migration du fragment ADN complexé par rapport à l’ADN seul
Conséquence: ADN-prot sera plus haut sur le gel que la bande d’ADN seul ou tout simplement seul malgré la mise en contact avec la protéine
V ou F: L’ADN seul et l’ADN non lié à une protéine migreront à la même vitesse et seront au même niveau dans le gel?
Vrai
Comment on est capable d’observer les interactions d’un fragment d,ADN
Grâce à un marqueur nommé la biotine, à la radioactivité ou avec des marqueurs fluorescents
Qu’est-ce qu’un super-complexe
-ADN marqué, protéine et Ac
Dans le retardement sur gel, est-ce qu’on rajoute un non-compétiteur
oui
I1: Préparation des oligonucléotides
Décrit la Préparation de l’ADN AP-1 marqué
1.On prends des oligonucléotides complémentaires avec une séquence consensus de liaison marqués à la biotine en 3’
2.On les mélange dans un MT et on l’incube à 95 degrés sur un BLOC CHAUFFANT
- Enlève de bain chauffant pour qu’ils atteingent Tpièce (ces 2 étapes permettent l’appariement des oligonucléotides sb complémentaires afin d’avoir un ADN marqué à la biotine en 3’ avec une séquence consensus AP-1)
- Dilution des oligo db pour essais de liaison
I1: Préparation des oligonucléotides
Décrit la Préparation de l’ADN AP-1 non marqué
- Des oligo non marqué à la biotine avec site AP-1 non muté et avec site AP-1 muté ont également été préparés
I2: Préparation des extraits nucléaires de cellules NIH 3T3
Comment elle se fait
Isole les noyaux des cellules puis on les lyse dans un tampon contenant bcp de sel (permet la récolte de protéines cytoplasmiques et membranaires).
Ensuite on centrifuge le lysat et on garde la fraction soluble
I2: Préparation des extraits nucléaires de cellules NIH 3T3
Explique l’induction des cellules NIH 3T3
- Elles ont été mises dans du D-MEM sans FBS pendant 24h
2.Elles sont ensuite induites avec FBS pendant 1h
I2: Préparation des extraits nucléaires de cellules NIH 3T3
Explique la Préparation de l’extrait nucléaire
- Centrifugation 1500 des cellules à 4 degrés
- Resuspendre les cellules dans tampon de lyse fort en sel (ICI c’est l’isolation des noyaux)
- Récolte des noyaux par centri 2500 à 4 degrés
- Suspension dans un tampon de lyse pour les noyau
- Incubation sous rotation à 4 degrés pendant 1h pour lyse complète de noyaux
6.On collecte le surnageant (contient prot nucléaire soluble) et on le conserve avec inhibiteur de protéases
I2: Préparation des extraits nucléaires de cellules NIH 3T3
Explique le Dosage de l’extrait nucléaire
- On utilise la méthode de Bradford pour connaitre la concentration en prot nucléaires
ON UTILISE 0,5 ug/ul
I3: Essai de liaison à la séquence consensus de la liaison Ap-1
Que fait-on AVANT les essais
Gel doit déjà être sur tension avant son chargement
I3: Essai de liaison à la séquence consensus de la liaison Ap-1
Décrit le processus
- Prépare les échantillons
2.Incubation T pièce
3.Ajout d’ADN marqué avec site Ap-1 à chacun des tubes et mélanger et incuber T pièce - Ajouter tampon de chargement LB-EMSA
- mettre sur gel d’acrylamide sous tension
I3: Essai de liaison à la séquence consensus de la liaison Ap-1
Que contiennent les 4 échantillons?
1: Eau et tampon de liaison 5X
2: Eau, tampon de liaison et Extrait nucléaire
3: Tampon de liaison, Extrait nucléaire et ADN non marqué avec site AP-1 non-muté
4: Tampon de liaison, Extrait nucléaire et ADN non marqué avec site AP-1 muté
I4: Migration des complexes sur gel de polyacrylamide 5% non dénaturant
Préparation du gel d’acrylamide: Que sont les 2 réactifs qu’on utilise pour le gel
TEMED et APS 10%
I4: Migration des complexes sur gel de polyacrylamide 5% non dénaturant
Préparation du gel d’acrylamide: On laisse polymériser cb de temps
30 min
I4: Migration des complexes sur gel de polyacrylamide 5% non dénaturant
Préparation du gel pour l’électrophorèse: que doit on faire avant l’électrophorèse
S’assurer que TBE 1X et 0,5X sont bien à 4 degrés
I4: Migration des complexes sur gel de polyacrylamide 5% non dénaturant
Préparation du gel pour l’électrophorèse: Décrit le fonctionnement
Installe le gel dans le support
Ajout TBE 1X
Rincer et mettre sous tension
I4: Migration des complexes sur gel de polyacrylamide 5% non dénaturant
Migration des échantillons: Décrit le fonctionnement
Déposer les 4 échantillons (I3)
Miger à 100V DANS UN CABINET RÉFRIGÉRÉ pour pas surchauffer le gel
I5: Transfert de l’ADN sur une membrane de nylon chargée positivement
Décrit le fonctionnement
1.Humidifie la membrane de nylon avec du TBE 0,5X
- Placer un papier whatman sec sur le gel
- Préparer le montage pour le transfert sur membrane de nylon chargée positivement
- Tube de verre pour enlever les bulles d’air
5.GLisse support dans la cassette de transfert et on la dépose dans le réservoir
6.On le remplit avec tampon 0,5X froid
- Cathode vers anode
- Pontage au UV
9.Membrane entre 2 papiers wattman pour la nuit
I6: Détection de l’ADN marqué à la biotine par chimieluminescence
explique le fonctionnement
La streptavidine lie la biotine qui elle est lié à une HRP (h2O2+ luminol—»signal)
